猪繁殖与呼吸综合征病毒3'非编码区末端序列结构与功能解析

摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是一种可以引起以怀孕母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为特征的猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的病毒，该病流行广，对养猪业危害严重。PRRSV基因组为单股正链RNA，全长约为15kb，包括5'端帽子结构、5'非编码区、10个开放阅读框、3'非编码区(3' UTR)和3'Poly(A)尾。PRRSV分为两个基因型:欧洲型(TyepⅠ)和北美型（TyepⅡ）。大量研究证明病毒负链基因组的复制，亚基因组mRNA的转录均始于3'末端，所以病毒基因组3' UTR在病毒复制过程中发挥着重要的作用。但是目前对于PRRSV3'UTR的调控功能还知之甚少。本研究以PRRSV3'UTR末端保守序列为研究对象，在本实验室建立的北美型PRRSV感染性克隆的基础上构建了一系列3'UTR末端序列突变体，研究病毒基因组末端的顺式调控元件在病毒复制过程的调控作用。现将研究内容简述如下:
　　 1 PRRS病毒基因组3'UTR的一级序列和二级结构的生物信息学分析利用生物学信息学软件MegAlign，RNAalifold和Mfold等对来自GenBank中100株PRRSV基因组3'UTR序列进行了分析。结果发现PRRSV两型3'UTR序列核苷酸同源性在69％-77％之间，序列中存在非常保守的序列(5'-AGUCACCUAUUCAAUUAGGG UGGG GGC AACCA CCG AAUU-3')，为下一步研究3' UTR的功能提供了重要信息。分析PRRSV3'UTR二级结构发现，PRRSV3'UTR具有保守的二级结构。两型均具有一个长的凸茎环结构，并且在顶端存在一个高保守的茎环结构，另外末端含有一段核苷酸单链，这种结构可能病毒复制的必需元件。
　　 2 PRRSV3'UTR末端序列5'-AAUU-3'对病毒复制影响的研究在Ⅱ型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)全长感染性克隆pAPRRS的基础上，利用突变PCR技术成功构建病毒基因组3'UTR末端序列5'-AAUU-3'的全长突变克隆:pAM01A、pAM01C、pAM01G、pAM02A、pAM02C、pAM02G、pAM03T、pAM03C、pAM03G、pAM04T、pAM04C、pAM04G。将这些突变体转染BHK-21细胞，通过间接免疫荧光(IFA)和RT-PCR的方法分别鉴定不同的突变位点对蛋白翻译和亚基因组及负链基因组合成的影响。同时将转染上清感染MARC-145细胞，通过观察它们所导致的细胞病变、空斑形态、生长曲线以鉴定定点突变对病毒感染性的影响，并通过RT-PCR检测拯救病毒序列变化。结果显示突变体pAM01C、pAM03T、pAM03G、pAM03C、pAM04G、pAM04C能够检测到结构蛋白N蛋白的正常表达及病毒亚基因组和负链基因组的合成，但是只有pAM01C、pAM04C和pAM04G能够拯救出病毒，pAM03T、pAM03G、 pAM03C未能产生CPE，表明3'末端第一位的碱基可以被替换成C，第二和第三位碱基是不能耐受任何突变的，而第四位碱基可以被替换成C和G，并且通过MFOLD分析所有突变体都保持着与APRRS一样的二级结构。
　　 3 PRRSV3'UTR末端序列5'-AACCA-3'结构功能的解析PRRSV3'UTR末端存在一个由保守序列5'-AACCA-3'构成的茎环结构，推测这段序列在病毒复制中发挥着重要作用，可能作为病毒的加尾信号。为了研究序列和茎环结构改变对病毒基因组的复制、亚基因组及负链基因组合成以及感染性的影响，本研究对Ⅱ型PRRSV全长感染性克隆3'UTR末端序列5'-AACCA-3'进行了一系列突变来改变其一级结构和二级结构，然后将这些突变体转染细胞。结果表明，由保守序列5'-AACCA-3'构成的茎环结构对于病毒复制是非必需的，而这段保守序列的一级结构的维持在病毒的复制过程中发挥着至关重要的作用。对保守序列5'-AACCA-3'中的单个碱基进行替换或缺失，不会影响病毒的复制，但这些变化会影响病毒在MARC-145细胞上的复制效率。但对这段保守序列进行系列缺失突变时，发现，5'-AACCA-3'中必须保留三个以上的碱基且保留的碱基中最后两个碱基为CA，才不会阻断病毒亚基因组合成和结构蛋白的表达，从而维持病毒的感染性，其他的缺失突变体都不能拯救出病毒。研究表明Ⅱ型PRRSV3'UTR末端保守序列5'-AACCA-3'的一级序列组成而非其构成的茎环结构对病毒的亚基因组合成和感染性至关重要，它可能作为病毒的加尾信号发挥重要的作用。
　　 综上所述，本研究针对PRRSV3'UTR末端序列对病毒复制的影响进行了解析，为进一步剖析PRRSV3'UTR的结构与功能的关系，及研发基因工程疫苗奠定了基础。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒国内外研究进展

1 病毒基本特征和基因组结构

2 病毒的转录调控机制

3 病毒基因组编码的非结构蛋白及其功能

4 病毒基因组编码的结构蛋白及其功能

5 PRRS疾病的防治

6 小结

参考文献

第二章 单股正链RNA病毒基因组3’ UTR结构与功能研究进展

1 3’ UTR结构测定方法

1．1 计算机方法预测RNA结构

1．2 试验法测定RNA结构

2 3’ UTR功能研究方法

3 3’ UTR结构与功能的关系

3．1 3’ UTR常见结构元件

3．2 3’ UTR一级序列与功能

3．3 3’ UTR二级结构与

3．4 3’ UTR高级结构与功能

4 问题与小结

参考文献

第三章 PRRSV基因组3’ UTR一级序列、二级结构的生物信息学分析

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 PRRSV 3’ UTR一级核苷酸序列比对

2．2 APRRSV 3’ UTR二级结构预测

3 讨论

参考文献

第四章 PRRSV 3’ UTR末端序列5’-AAUU-3’对病毒复制影响的研究

1 材料和方法

1．1 质粒和细胞

1．2 试剂

1．3 主要仪器

1．4 PRRSV 3’ UTR 5’-AAUU-3’突变质粒特性鉴定

2 结果

2．1 间接免疫荧光鉴定

2．2 病毒正负链基因组及亚基因组的检测

2．3 突变病毒的拯救和突变病毒基因组鉴定

2．4 突变病毒生长特性分析

3 讨论

参考文献

第五章 PRRSV 3’ UTR末端序列5’-AACCA-3’结构功能的解析

1 材料和方法

1．1 质粒和细胞

1．2 试剂

1．3 主要仪器

1．4 茎环结构突变体的构建

1．5 一级序列单位点突变体的构建

1．6 一级序列缺失突变体的构建

1．7 突变体转染BHK-21细胞

1．8 间接免疫荧光试验(IFA)

1．9 病毒正负链基因组及亚基因组的检测

1．10 转染上清盲传

1．11 突变病毒的鉴定

1．12 病毒生长特性研究

2 结果

2．1 茎环结构突变体的鉴定及结构分析

2．2 茎环结构突变体间接免疫荧光鉴定

2．3 茎环结构突变体正负链基因组及亚基因组的检测

2．4 一级结构突变体的鉴定

2．5 突变体间接免疫荧光鉴定

2．6 突变体正负链基因组及亚基因组的检测

2．7 突变病毒的拯救和突变病毒的基因组鉴定

2．8 突变病毒生长特性分析

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢