大豆抗大豆疫霉根腐病的比较蛋白质组学研究

摘要

由大豆疫霉引起的大豆疫霉根腐病是一种毁灭性的大豆病害，广泛分布于世界各大豆产区。目前该病已经在我国一些大豆主产区发生和为害，并在局部地区造成较大产量损失，对我国的大豆生产造成很大的危害。应用抗、耐病品种是防治该病害最经济、安全、有效的途径。
　　 蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命的变化机制。基因转录水平的研究只能在一定程度上反映基因表达产物的变化，而真正发挥功能的蛋白质需要经过转录后加工、翻译调控以及翻译后加工等许多步骤和调控才能形成。因此，蛋白质组学已广泛应用于植物功能基因组学的研究。
　　 本研究主要利用蛋白质组学技术对大豆和大豆疫霉互作过程中的蛋白质表达谱进行研究，并对鉴定蛋白点的功能进行分析。其目的主要是从蛋白表达水平上挖掘一些与大豆疫霉根腐病抗性有关的蛋白，进一步探讨这些蛋白在大豆—大豆疫霉互作过程中所参与的代谢途径以及大豆抗大豆疫霉根腐病的分子机制。主要研究结果如下:
　　 1.大豆抗感种质接种大豆疫霉后的比较蛋白质组学研究
　　 本实验采用下胚轴创伤接种法，利用2-DE结合MALDI-TOF/TOF技术探讨大豆抗病品种豫豆25和感病品种NG6255在接种大豆疫霉菌株PNJ1后大豆下胚轴蛋白在蛋白水平上的变化。结果表明，与未接种大豆疫霉的植株相比，共检测到46个差异表达蛋白点。在抗病品种豫豆25中检测到26个差异表达蛋白点，其中12个上调表达，14个下调表达;在感病品种NG6255中，检测到20个差异表达蛋白点，11个上调表达，9个下调表达。在这些差异表达蛋白中，26％与能量调控有关，15％涉及蛋白命运，11％涉及抗病防卫，11％与代谢有关，9％涉及蛋白合成，参与次生代谢的占4％，另外未知蛋白达到24％。
　　 2.不同处理条件下大豆根、茎和叶的比较蛋白质组学分析
　　 利用2-DE结合MALDI-TOF/TOF技术以感大豆疫霉菌株P6497的新沂小黑豆为材料，对SA、MeJA、ACC、H2O2、SNP、VB1以及P.sojae处理条件下大豆根、茎和叶进行蛋白质组学分析。结果表明:根中鉴定的35个蛋白点中，与抗病防卫及次生代谢有关各占23％,17％与代谢有关，其次是参与蛋白合成、蛋白命运、转录和代谢调控的，与细胞结构和信号转导有关的最少，各占3％，功能未知蛋白占8％。参与次生代谢有关的蛋白主要与乙烯、茉莉酸和类黄酮生物合成有关。茎中鉴定的58个蛋白点中，与能量和代谢有关的达到41％，参与抗病防卫和次生代谢的各占12％，10％与蛋白命运有关，与信号转导和转录有关的各占7％，与细胞结构有关的占4％，与蛋白合成和运输有关的各占2％。叶中鉴定到21个蛋白点，与能量有关的最多，达到62％，其次是与次生代谢、蛋白合成和代谢有关的，与蛋白命运和转录有关的最少，为5％。与能量有关的蛋白主要参与光合和光呼吸过程。
　　 3.基于iTRAQ的大豆对大豆疫霉根腐病根的蛋白质表达谱分析
　　 本实验采用根部创伤接种法，利用iTRAQ定量蛋白质组学技术研究抗大豆疫霉菌株Pm14材料苏88-M21接种后3d大豆根的蛋白质表达谱的变化。共鉴定出2136个蛋白，其中差异表达蛋白280个。这280个差异表达蛋白点中，与抗病防卫有关的最多，达到16％,14％与蛋白命运有关，12％参与代谢调控，与能量和蛋白合成有关的各为11％，8％与信号转导有关，6％与运输有关，参与次生代谢的占6％，4％与细胞结构有关，2％与转录有关，与细胞生长/分裂有关的最少，仅为1％，未知功能蛋白占9％。茉莉酸、乙烯、生长素以及泛素-蛋白酶体参与大豆抗大豆根腐病的抗性机制。

目录

声明

摘要

缩略词表及其英汉对照

第一章 文献综述

1 大豆疫霉根腐病概述

1．1 大豆疫霉根腐病的起源、分布与危害

1．2 大豆疫霉病原菌的研究

1．3 大豆疫霉引起的病害症状

1．4 大豆疫霉的致病规律

1．5 大豆疫霉根腐病的防治

2 大豆对大豆疫霉根腐病的抗性研究

2．1 大豆疫霉根腐病抗源筛选

2．2 大豆疫霉根腐病抗性类型

2．3 大豆疫霉根腐病抗性鉴定方法

2．4 大豆疫霉根腐病抗性基因的定位与克隆

3 蛋白质组学研究进展及应用

3．1 蛋白质组学研究内容

3．2 蛋白质组学技术研究进展

3．3 大豆蛋白质组学研究进展

4 本研究目的和意义

第二章 大豆抗感种质接种大豆疫霉后的比较蛋白质组学研究

1 材料和方法

1．1 大豆疫霉菌株和材料

1．2 蛋白样品的制备

1．3 2-DE、胶染色以及图像分析

1．4 胶内酶解、质谱分析、数据搜索

2 结果与分析

2．1 豫豆25和NG6255接种大豆疫霉的表型比较

2．2 接种和未接种大豆疫霉的蛋白质组学表达模式分析

2．3 差异蛋白点的鉴定和功能分类

3 讨论

3．1 与代谢和能量调控有关的蛋白

3．2 与抗病防卫有关的蛋白

3．3 与蛋白合成、命运有关的蛋白

3．4 与次生代谢有关的蛋白

3．5 功能未知蛋白

4 结论

第三章 不同处理条件下大豆根茎叶的比较蛋白质组学分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 大豆疫霉菌株及游动孢子的诱导

1．3 大豆植株的处理

1．4 蛋白样品的制备

1．5 2-DE、胶染色、图像分析以及胶内酶解、质谱分析、数据搜索

1．6 鉴定蛋白点的亚细胞定位、信号肽和功能分析

2 结果与分析

2．1 新沂小黑豆对大豆疫霉菌株P6497的表型分析

2．2 不同处理根、茎和叶的蛋白质表达模式分析

2．3 鉴定蛋白点的生物信息学分析

3 讨论

3．1 根中鉴定蛋白点的功能注释

3．2 茎中鉴定蛋白点的功能注释

3．3 叶中鉴定蛋白点的功能注释

4 结论

第四章 基于iTRAQ的大豆对大豆疫霉根腐病根的蛋白质表达谱分析

1 材料和方法

1．1 植物材料及接种方法

1．2 iTRAQ实验流程

1．3 MS/MS分析

1．4 蛋白的功能分类及亚细胞定位

2 结果与分析

2．1 苏88-M21对大豆疫霉菌株Pm14的抗性分析

2．2 基于iTRAQ的蛋白表达谱分析

2．3 鉴定蛋白点的生物信息学分析

3 讨论

3．1 接种大豆疫霉后呼吸和ATP耦联的转运过程的改变

3．2 接种大豆疫霉后细胞壁重塑的改变

3．3 抗病防卫反应的激活

3．4 信号转导参与的调控途径

3．5 与次生代谢有关的蛋白

3．6 激素信号参与的调控

4 结论

全文结论

本研究创新之处

附录

参考文献

攻读博士期间发表或待发表的研究论文

致谢