二化螟田间种群对CrylA毒素的敏感性及钙粘蛋白基因的多态性和mRNA表达水平

摘要

二化螟Chilo suppressalis(Walker)是水稻上的一种重要害虫，对水稻的产量和质量造成重大损失，主要依靠化学农药进行控制。但长期大量使用化学农药，导致二化螟对其产生抗性，使得防治更加困难，同时对周围生态环境产生严重影响。转Bt基因水稻为二化螟的防治提供了一种新方法。在中国转Bt基因抗虫水稻已于2009年获得生物安全证书，有可能在几年后完成相关的后续评估实现商业化种植。二化螟作为转基因Bt水稻的主要靶标害虫之一，其抗性风险是影响转基因水稻长期田间应用的重要因素之一。因此在其大规模商业化种植之前，开展我国田间二化螟种群对Bt毒素的敏感性调查，可以为今后二化螟对Bt水稻抗性风险评估与抗性监测打下良好的基础，相关结果可以作为评价抗性发展水平的重要依据。本文调查了三种Cry1A毒素对室内敏感种群及五个田间二化螟种群的毒力，同时对二化螟潜在的Bt毒素受体钙粘蛋白(cadherin)进行了基因克隆、多态性分析和mRNA表达检测。相关研究结果总结如下：
　　 ⑴Cry1A毒素对二化螟敏感种群及田间种群的毒力。对2011年采自浙江温州(WZ)、江西瑞昌(RC)、安徽和县(HX)、江苏大丰(DF)和湖北荆州(JZ)5地秧田的二化螟种群以及室内敏感品系(CN)进行Cry1A毒素(Cry1Aa、 Cry1Ab、 Cry1Ac)的敏感性测定。结果显示，对敏感品系CN的毒力，Cry1Ab最高，LC50为0.229μg/cm2;其次是Cry1Aa，LC50为0.240μg/cm2;毒力最低为Cry1Ac，LC50为0.277μg/cm2。 Cry1Ab、C巧1Aa和Cry1 Ac对5个田间种群的LC50分别在0.147～0.304、0.152～0.335和0.170～0.351μg/cm2之间。各田间种群对Cry1A毒素的敏感性差异不显著（＜2倍），对三种Cry1A毒素的敏感性基本均表现为Cry1 Ab＞Cry1 Aa＞Cry1 Ac。目前，Bt水稻还未进行商业化种植，二化螟田间种群对Cry1A毒素的敏感水平与室内长期饲养的敏感品系相当，甚至更敏感，Bt水稻的种植可以有效减轻二化螟的为害。但为了确保Bt水稻对靶标害虫的长期有效控制，抗性监测和预防性抗性治理方法的相关基础研究工作必须提前展开。
　　 ⑵二化螟田闻种群钙粘蛋白基因的多态性和mRNA表达水平。根据已有的二化螟钙粘蛋白基因CsCAD(GenBank: DQ821523.2)的序列，进行了室内敏感品系和四个田间二化螟种群（除大丰种群外）的钙粘蛋白基因的克隆和序列测定。结果显示:5个种群共15个不同钙粘蛋白基因单克隆间碱基和氨基酸的序列差异均不大，全长5148个碱基中有179个碱基存在多态性，约占总碱基数的3.48％;编码的1715个氨基酸中，有100个氨基酸位点存在多态性，约占氨基酸总数的5.83％。同一种群的3个钙粘蛋白基因间的序列相似性极高，都在99％左右;5个不同种群的每个钙粘蛋白序列与CsCAD比较，相似性均超过99％。存在差异的氨基酸平均分布在钙粘蛋白各结构域内，没有在某结构域集中出现的情况。通过实时定量PCR检测发现，室内敏感品系和四个田间二化螟种群钙粘蛋白基因在mRNA表达水平上有一些差异，但差异不显著。JZ种群的钙粘蛋白表达量最高，为1.292，高于敏感种群CN表达量1，其他3个种群表达量均低于CN，其中RC种群钙粘蛋白的表达量最低，只有0.639，WZ和HX的表达量分别为0.656和0.809。从钙粘蛋白序列多态性和mRNA表达量两方面的结果看出，各种群之间的变异较小。二化螟钙粘蛋白已证实可以结合Bt毒素，但是否为有效的毒素功能受体还需进一步验证。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 水稻螟虫的发生现状

1．1 二化螟的发生与为害

1．2 其他螟虫的发生与为害

1．3 稻螟重发原因及防治面临的问题

2 转基因作物研究现状

2．1 转基因作物种植现状

2．2 转基因抗虫水稻

2．3 转基因水稻安全性评价

2．4 转基因水稻安全性保障措施

3 昆虫对Bt毒素的抗性研究概况

3．1 Bt毒素概述

3．2 Bt毒素的作用机理

3．3 Bt毒素在昆虫中肠内的结合受体

3．4 昆虫对Bt毒素的抗性

3．5 转Bt作物的抗性治理策略

4 本研究的目的和意义

第二章 二化螟田间种群对Cry1A毒素敏感性调查

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 生物测定方法(毒素涂表法)

1．3 统计分析方法

2 结果和分析

2．1 室内敏感品系和田间神群F0代对不同Cry1A毒素的敏感性

2．2 田间种群F1代对不同Cry1A毒素的敏感性

2．3 田间二化螟种群对不同Cry1A毒素敏感性的相关性分析

3 讨论

第三章 不同种群二化螟钙粘蛋白基因的序列多态性及mRNA表达水平

1 材料和方法

1．1 供试二化螟

1．2 供试药剂和仪器设备

1．3 二化螟钙粘蛋白基因的克隆

1．4 二化螟钙粘蛋白基因mRNA表达量的研究

2 结果与分析

2．1 二化螟钙粘蛋白基因的克隆及序列分析

2．2 钙粘蛋白基因系统进化树构建

2．3 不同田间种群钙粘蛋白基因的多态性分析

2．4 田间种群钙粘蛋白基因相对表达量研究

3 讨论

全文总结

参考文献

附录

致谢