慢病毒载体介导RNAi法抑制小鼠卵泡颗粒细胞血管内皮生长因子(VEGF)A表达的研究

摘要

血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）是胱氨酸结生长因子中的血小板起源的生长因子亚家族，胱氨酸结生长因子作为细胞产生的一个信号蛋白来刺激血管发生和血管生成。VEGF的正常功能是在胚胎发育中、损伤之后、运动之后肌肉中产生新的血管以及绕过阻塞血管产生新的血管。研究已经发现VEGF在颗粒细胞的诱导增值和分化中起到重要的作用，并且通过RNA干扰（RNA interference，RNAi）上调和下调VEGF可以提供一个强大的工具来研究VEGF在这些细胞中发挥功能的细节。RNAi是一个序列特异性的转录后基因沉默机制，它是由一个感兴趣的特异性基因的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)的引入而引发的。最近，研究者已经将短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)整合到慢病毒载体中，以此成功传递siRNA到哺乳动物细胞中并获得稳定基因沉默。VEGF的shRNA可作为潜在的策略来敲低VEGF，并检测shRNA对小鼠颗粒细胞(mouse granulosa cells，MGC)中VEGF受体及凋亡基因的影响。在我们的实验中，我们构建了四种靶向小鼠VEGF A基因的shRNA表达质粒，并探索这些质粒对体外培养的MGC中VEGF表达的影响。我们设计了四种不同的靶向小鼠VEGF A基因mRNA编码序列的shRNA和一个阴性对照shRNA(negativecontrol shRNA，shNC)，并把他们分别克隆到pGPU6/GFP/Neo siRNA表达载体中，然后瞬时转染到MGC中。转染48小时后从细胞中提取总RNA，并做qRT-PCR分析。使用其中最有效的干扰质粒shVEGF1487来构建慢病毒载体，并将这个慢病毒载体通过lipofectamineTM2000介导基因转移的方式转染到293FT细胞中，来生产慢病毒，然后超速离心浓缩。使用浓缩后的慢病毒侵染MGC后，我们通过qRT-PCR检测VEGF A基因、凋亡基因及VEGF A受体基因的表达;通过酶联免疫吸附测定培养基中VEGF A蛋白水平;通过蛋白印迹检测MGC中VEGF A蛋白水平。与shNC和对照比较，四种shVEGF载体均能显著的敲低VEGF A基因、受体基因和凋亡基因。慢病毒载体也能显著敲低VEGF A基因。shVEGFs组培养基中的蛋白含量低于shNC和空白组。在蛋白印迹实验中大多数shVEGF组中蛋白水平低于shNC和空白组，只有VEGF1359高于shNC组但低于空白组。慢病毒侵染的MGC也表现出低的蛋白水平。这些发现表明，通过shVEGF表达质粒或慢病毒载体介导的RNAi是一种抑制VEGF及它的受体基因、凋亡基因的有效工具。

目录

声明

CONTENTS

摘要

Abstract

Table of Abbreviations

Chapter 1：Characteristics of the VEGF Gene

1．Introduction

2．VEGF Receptors

2．1 Flt-1

2．2 Flk-1

2．3 Flt-3

3．The involvement of VEGF in apoptosis

3．1 Bcl-2

3．2 Bax

3．3 FasL

3．4 TRAIL

3．5 FoxO4

4．Conclusion

Chapter 2：RNAi

1．Introduction

1．1 Mechanism of RNAi

1．2 Post-transcriptional gene silencing by siRNAs

1．3 microRNA

1．4 Transcriptional gene silencing by siRNAs

1．5 siRNA import method

1．6 Non viral delivery of RNAi inducing agents

1．7 Increase stability of siRNAs by chemical modifications

1．8 Non selective systemic delivery of siRNAs

1．9 Selective systemic delivery of siRNAs

1．10 DNA plasmid delivery strategy

1．11 Viral delivery of RNAi inducing agents

2．Conclusion

Chapter 3：Inhibition of Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGFA) expression in MGC by Lentivector-mediated RNAi

1．Introduction

2．Materials and Methods

2．1 Construction of shRNA Plasmid

2．2 Laboratory Animals and Granulosa Cell Culture

2．3 Transfection of MGC with shRNA Plasmids

2．4 RNA Isolation and Quantitative Real-Time PCR analysis

2．5 ELISA

2．6 Western Blotting

2．7 Construction of Lentivirus Vector for the Delivery of shRNA

2．8 Production of Lentivirus in 293FT Cells

2．9 Transduction of MGC with Lentivirus vector

2．10 Statistical Analysis

3．Results

3．1 Construction of shRNA Expression Vector against VEGF

3．2 Inhibition of VEGF Expression by shRNA Plasmid Constructs and Lentivirus

3．3 Effect of shRNA Plasmid Constructs on VEGF Receptor Gene expression

3．4 Effect of shRNA Plasmid Constructs on VEGF Apoptosis Gene expression

3．5 Effect of shRNA Plasmid Constructs and Lentivirus on VEGF Protein Levels

4．Discussion

5．Conclusion

Appendix 1 Formulation of Main Reagents

Appendix 2 Expression vector sequencing map and comparison results

References

Acknowledgement