Paenibacillus polymyxa JSa-9抗菌物质的结构鉴定及小麦生防应用研究

摘要

多年来，开发高效、安全无毒、性能稳定、广谱天然的抗菌物质一直是食品、医药、农业等领域的研究和应用热点。芽孢杆菌在自然界分布非常广泛，生理特性丰富多样，是土壤和植物微生态优势种群之一。本研究的目的在于从土壤中筛选出能产生活性高、抗菌谱广、安全的抗菌物质的菌株，对其抗菌物质进行分离纯化和结构鉴定，利用响应曲面法提高抗菌物质的产量，并评价其对小麦赤霉病菌的离体和活体条件的防治效果。研究结果分述如下:
　　 1.广谱抗菌活性芽孢杆菌的筛选及分类鉴定.从不同来源的六份土壤样品中根据形态不同共分离得到119株产芽孢杆菌，通过琼脂块法初筛及摇瓶发酵法复筛高效率地从中找出具有广泛抗菌谱的9株菌株。其中菌株JSa-9的抑菌谱最广，且抑菌活性强，不仅能较好地抑制革兰氏阳性细菌（Micrococcus luteus和Staphylococcus aureus）、革兰氏阴性菌（Escherichia coli和Pseudomouas fluorescens），而且对霉菌（Aspergillusniger和Penicillium notatum）也有显著的抑制作用。通过形态特征、培养特征和生理生化特性分析，初步判定其属于类芽孢杆菌属。分子生物学鉴定结果显示，JSa-9的16S rRNA基因序列和数据库中相似度最高的前14株菌均为多粘类芽孢杆菌，而且相似性均达到99％。在细菌系统发育分类学上，菌株JSa-9归属多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，GenBank登录号为EU882855，并已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC No.4314)。
　　 2.P.polymyxa JSa-9发酵液中抗菌糖蛋白的纯化和鉴定.P.polymyxa JSa-9的发酵上清液采用20～80％饱和度的硫酸铵分级盐析、DEAE-Sephacel离子交换层析及Sephadex G-100凝胶过滤层析纯化得到一种电泳纯分子量约为71.9 kDa的抗菌蛋白，并通过高碘酸-Schiff反应定性为糖蛋白。抑菌试验发现，该糖蛋白对3株革兰氏阳性细菌（M.luteus、B.cereus和S.aureus）、2种革兰氏阴性细菌（E coli和P.fluorescens）以及5种霉菌（A.niger、P.expansum、A.oryzae、P.notatum和R.stolonifer）均具有显著的抑制效果。氨基酸组成分析显示，该蛋白含有11种氨基酸，富含Valine(30.2％)、Tyrosine(14.1％)、Lysine(12.6％)以及Threonine(11.5％)，此四种氨基酸占总量的68％,氨基酸残基数约为294个，其N端前12个氨基酸序列经测定为Lys-Cys-Ala-Thr-Ile-Pro-Val-Val-Ile-Lys-His-Leu。通过BLAST软件在NCBI网站中进行比较未发现同源蛋白，可判断该抗菌糖蛋白为一种新物质。苯酚-充酸法测定表明，该蛋白含糖量约为28％。
　　 3.P.polymyxa JSa-9产脂肽LI-F、polymyxin B6及DBP的分离和鉴定.由乙酸乙酯从P.polymyxa JSa-9菌株发酵上清液中萃取得到抗菌粗提物，再经RP-HPLC纯化后，过柱液在UV210nm检测下出现4个活性峰。其中前三个峰表现出相似的抗菌活性，均只对革兰氏阳性细菌（M.luteus、B.cereus和S.aureus）和霉菌（A.niger、P.expansum、A.oryzae、P.notatum和R.stolonifer）有抑制作用;而第四个峰显示出广谱的抗菌活性，对M.luteus、B.cereus、S.aureus、E.coli、P.fluorescens、A.niger、P.expansum、A.oryzae、P.notatum和R.stolonifer均有效果。将四个活性峰经LC-MS结果显示，前三号峰分别含有一系列m/z883.82、897.16、897.28、911.87、947.69和961.67的物质，与LI-F类抗菌脂肽同系物的分子量相同;而四号峰含有m/z278.89的物质，与邻苯二甲酸二丁酯的分子量相吻合。随后MS/MS分析验证了上述结果，分子量为883、897、911、947和961Da的物质二级质谱断键方式和离子碎片峰与LI-F的分子结构相似，最终被分别鉴定为LI-F03a、LI-F03b、LI-F04a、LI-F04b和LI-F05b等五种LI-F脂肽，而分子量为278 Da的物质被确定为邻苯二甲酸二丁酯(DBP)。
　　 采用超声波破碎和溶媒浸提法相结合获得P.polymyxa JSa-9菌体细胞内的抗菌粗提物，再经HPLC分离得到两个主要的活性峰（峰A和B）。其中前者对革兰氏阳性细菌和阴性菌（包括M.luteus、B.cereus、S.aureus、E.coli和P.fluorescens）均具有抑菌活性，而后者能抑制革兰氏阳性菌和植物病原真菌（M.luteus、B.cereus、S.aureus、A.niger、P.expansum、A.oryzae、P.notatum和R.stolonifer）。将HPLC分离到的活性峰A与B分别进行LC-MS分析，峰A呈现出[M+H+]为m/z1219.72的信号，分子量与polymyxin B6非常吻合;而峰B出现了m/z901.55和915.51两个信号，与抗菌脂肽LI-F04的分子量较为接近，分别与LI-F04a和LI-F04b相差18 Da。MS/MS分析表明，m/z1219.72的抗菌组分所含部分氨基酸序列为Dab-Thr-Dab-Dab-Thr-Dab-Dab，m/z901.55和915.51的分子结构中的部分氨基酸序列分别为Val-Val-Thr-Asn-Ala和Val-Val-Thr-Gln/Lys-Ala。氨基酸分析显示，峰A所含各种氨基酸的摩尔比为Dab∶Thr∶Phe∶Leu/Ile=6∶2∶1∶1，与polymyxin B6相同;而峰B有着与LI-F04相同的氨基酸组成，含有Thr、Ala、Val、Asn和Gln，摩尔比为4∶2∶4∶1∶1。红外光谱试验进一步证明，峰A中的抗菌脂肽为多粘菌素B6;而峰B未出现内酯键的特征吸收，被分别鉴定为两种新型直链型的脂肽LI-F04a和LI-F04b。
　　 4.P.polymyxa JSa-9产抗菌脂肽LI-F的发酵工艺优化.发酵培养基筛选发现，Landy培养基能产生较高产量的抗菌脂肽LI-F。采用PB设计法对影响LI-F发酵的培养基组成和外在条件的关键因素进行筛选，结果表明，在所选取的13个相关因子中，对LI-F产量具有显著影响的因子是KCl、FeSO4、MgSO4和CuSO4。在PB试验结果的基础上，采用BBD响应曲面法对影响LI-F发酵的4个关键影响因素的最佳水平范围及其交互作用进行优化，并建立了预测模型方程。通过模型方程3D图及等高线图结果显示，在KCl1.1 g/L，FeSO40.27 mg/L，MgSO40 g/L、CuSO40.64 mg/L的条件下，可获得LI-F产量的最大预测值。优化后的培养条件下脂肽产量达到733.9 mg/L，约为起始的工艺下产量的1.7倍。
　　 5.LI-F在离体和活体试验中对小麦赤霉病菌的防治效果测定.P.polymyxa JSa-9产抗菌脂肽LI-F对小麦赤霉病菌菌丝的生长和孢子的萌发均具有明显的抑制作用。LI-F对菌丝生长的有效抑制中浓度(EC50)为13.69μg/mL。在30μg/mL浓度下，LI-F既能完全抑制赤霉病孢子的萌发，没有芽管形成。人工接种小麦赤霉病菌的防效结果表明，喷施800μg/mL浓度的脂肽LI-F对小麦赤霉病菌的治疗作用优于保护作用，防效可达到75.19％，略高于多菌灵的73.1％。

目录

声明

摘要

表格索引

图形索引

缩略词表

第一章 文献综述

1 多粘类芽孢杆菌研究介绍

1．1 多粘类芽孢杆菌的分类地位

1．2 多粘类芽孢杆菌的应用

2 多粘类芽孢杆菌产抗菌物质的研究进展和应用现状

2．1 多粘类芽孢杆菌抗菌物质种类及理化性质

2．2 多粘类芽孢杆菌抗菌物质的作用机制

2．3 抗菌物质的分离纯化与结构鉴定

2．4 多粘类芽孢杆菌抗菌物质的应用进展

2．5 展望

3 本研究的目的意义及内容

参考文献

第二章 广谱抗菌活性菌株JSa-9的分离筛选与种属鉴定

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 抗菌活性菌株的分离筛选

2．2 菌株JSa-9的培养特征及生理生化鉴定

2．3 菌株JSa-9的分子生物学鉴定

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第三章 Paenibacillus polymyxa JSa-9产抗菌蛋白的分离纯化及结构鉴定

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 P．polymyxa JSa-9生长曲线测定

2．2 抗菌蛋白硫酸铵分级沉淀

2．3 抗菌蛋白DEAE-Sephacel离子交换层析

2．4 抗菌蛋白Sephadex G-100凝胶过滤色谱

2．5 抗菌蛋白的纯度鉴定和分子量测定

2．6 抗菌蛋白糖组分分析

2．7 抗菌蛋白N端氨基酸序列测定和氨基酸组成分析

2．8 抗菌蛋白酶活性检测

2．9 抗菌蛋白抗菌谱测定

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第四章 Paenibacillus polymyxa JSa-9产抗菌肽的分离纯化及结构鉴定

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 P．polymyxa JSa-9胞外抗菌肽的分离纯化及结构鉴定

2．2 P．polymyxa JSa-9胞内抗菌肽的分离纯化及结构鉴定

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第五章 Paenibacillus polymyxa JSa-9产抗菌脂肽LI-F发酵工艺优化

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 不同发酵培养基对抗菌脂肽LI-F产量的影响

2．2 抗菌脂肽LI-F发酵关键因子的确定

2．3 响应曲面法优化抗菌脂肽LI-F发酵工艺

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第六章 Paenibacillus polymyxa JSa-9产抗菌脂肽LI-F对小麦赤霉病的生防作用

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 脂肽LI-F对小麦赤霉病菌的抑菌活性测定

2．2 脂肽LI-F对小麦赤霉病菌菌丝生长的影响

2．3 脂肽LI-F对小麦赤霉病菌孢子萌发的影响

2．4 脂肽LI-F对小麦赤霉病的防治效果

3 讨论

4 本章小结

参考文献

全文结论

创新摘要

展望

攻读博士期间发表论文及申请专利情况

致谢