二花脸猪TGFBR2基因的克隆与表达水平分析

摘要

二花脸猪是我国太湖猪中最优秀的品种之一，以繁殖力高而闻名，但其高繁殖力遗传机制尚不明确。TGFBR2基因是转化生长因子β超家族中的一员，在哺乳动物卵巢颗粒细胞增殖、分化、卵泡发育和繁殖性能等方面发挥重要作用。目前关于TGFBR2基因与二花脸猪繁殖性能关系方面的研究还未见报道。本研究拟以我国高繁殖力猪种二花脸猪为研究对象，采用克隆测序技术获得二花脸猪TGFBR2基因编码区序列，并利用生物信息学方法分析其序列特征;采用RT-PCR技术和免疫组化技术分析二花脸猪TGFBR2基因的组织表达特征和卵巢组织细胞表达特征，并采用real-time PCR技术和western blot技术检测二花脸猪与商品猪卵巢组织中TGFBR2基因mRNA和蛋白表达水平;采用real-time PCR技术检测猪卵泡闭锁过程中TGFBR2基因mRNA表达水平的变化;采用生物信息学方法和荧光素酶双报告基因系统筛选TGFBR2基因的调控miRNA。探讨TGFBR2基因与二花脸猪高繁殖力性状形成之间的的关系，为揭示二花脸猪高繁殖力性状形成的分子机制提供理论依据。全文研究结果如下:
　　 1.二花脸猪TGFBR2基因的克隆和序列分析
　　 本研究成功获得了二花脸猪TGFBR2基因的编码区序列，序列全长为1461bp，与哺乳动物其它物种的一致性为74-84％。二花脸猪TGFBR2基因编码蛋白含486个氨基酸残基，与哺乳动物其它物种的一致为88-97％。结构域预测发现，二花脸猪TGFBR2蛋白与人、小鼠等哺乳动物一样，含有跨膜结构域、Pkc结构域等典型的功能域。三级结构预测显示二花脸猪TGFBR2蛋白由6个α-螺旋、7个β-叠结构和不规则卷曲组成。利用TGFBR2氨基酸序列构建的哺乳动物NJ系统发育树，聚类结果与经典分类学相吻合。研究结果表明二花脸猪TGFBR2基因与哺乳动物其它物种同源性较高，推测其与其它哺乳动物TGFBR2蛋白类似，在卵泡发育过程中发挥着重要作用。
　　 2.二花脸猪TGFBR2表达特征和卵巢组织表达水平
　　 RT-PCR检测发现TGFBR2基因在二花脸猪下丘脑、垂体、卵巢等12种组织中广泛表达，特别是在卵巢组织中高表达。免疫组化分析发现TGFBR2在猪卵泡的各个发育阶段均有表达，主要分布在卵母细胞和颗粒细胞中。Real-time PCR检测发现二花脸猪卵巢组织中TGFBR2基因mRNA表达水平显著高于商品猪(P＜0.05)。Westernblot分析发现二花脸猪卵巢组织中TGFBR2蛋白表达水平显著高于商品猪(P＜0.05)。研究结果表明卵巢组织中TGFBR2基因和蛋白表达水平可能与二花脸猪的高繁殖力有关，是影响二花脸高繁殖力性状形成的候选基因。Real-time PCR法对猪健康卵泡、早期闭锁卵泡和晚期闭锁卵泡中TGFBR2基因mRNA表达水平进行了分析，研究结果表明TGFBR2基因与猪卵泡早期闭锁有一定的关系，可能通过影响卵泡液中E2的合成影响卵泡闭锁。
　　 3.猪TGFBR2基因调控miRNA的初步筛选
　　 根据生物信息学网站预测，获得了29个调控TGFBR2基因的候选miRNA，结合课题组前期利用miRNA芯片检测猪卵泡闭锁过程中miRNA表达谱，结果发现miR-21既是TGFBR2基因的候选调控miRNAs，也是猪卵泡闭锁过程中差异表达的miRNAs(P＜0.000001)。将miR-21 minics和构建的TGFBR2基因3'UTR荧光素酶报告基因载体共转染Hela细胞，结果发现转染24h和48h后，miR-21 minics组报告基因的活性极显著低于对照组（minics NC组）(P＜0.01)，说明过表达miR-21可极显著抑制报告基因的活性，验证了miR-21对猪TGFBR2基因具有调控作用，是猪TGFBR2基因的调控miRNA.

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1 TGF-β配体

2 TGF-β受体

3 TGFBR2基因的结构

4 TGFBR2基因的组织表达特征

5 TGFBR2基因的生物学功能

6 TGFBR2基因的调控

6．1 Smads蛋白介导的TGFβ信号传导

6．2 miRNA对TGFBR2的调控

第二章 试验研究

1 材料和方法

1．1 试验动物

1．2 主要试剂和仪器

1．3 细胞系、菌株及质粒

1．4 试验方法

1．5 猪TGFBR2基因调控miRNA的初步筛选

1．6 数据分析

2 结果与分析

2．1 二花脸猪TGFBR2基因序列分析

2．2 二花脸猪TGFBR2基因氨基酸序列及理化性质分析

2．3 二花脸猪TGFBR2蛋白三级结构及系统发育分析

2．4 二花脸猪卵巢组织TGFBR2基因表达水平分析

2．5 猪卵泡闭锁过程中TGFBR2基因mRNA表达水平变化

2．6 猪TGFBR2基因调控miRNA的初步筛选

3 讨论

3．1 二花脸猪TGFBR2基因的序列和结构特征

3．2 二花脸猪TGFBR2的组织表达特征和卵巢组织细胞表达特征

3．3 二花脸猪卵巢组织TGFBR2转录与翻译水平

3．4 TGFBR2在猪卵泡闭锁过程中的作用

3．5 猪TGFBR2基因调控miRNA的初步筛选

参考文献

全文结论

全文创新点

附录

致谢