猪链球菌2型对细胞的粘附作用和炎症相关细胞因子转录的影响

摘要

猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype2，SS2）是一种是在世界范围内引起猪多种形式感染的病原;也是一种人畜共患病病原，可引起人脑膜炎，严重危害着养猪业及相关从业人员的安全。目前虽然SS2感染后致病机理仍然没有完全明确，但认为细菌粘附作用及炎症反应在致病过程中起重要作用。细菌粘附并侵袭细胞在细菌定植黏膜屏障过程中不是必须的，但它们是细菌定植的重要一步。一旦细菌进入血液循环和/或达到深层组织，将会受到先天性免疫系统中吞噬细胞的作用;但SS能够抵御吞噬作用，并以高浓度细菌在血液中持续存在，结果引发炎症。但细菌粘附能力是否可以作为细菌致病力的标志，不同SS2菌株粘附能力的差异的分子机制仍未得到很好的阐明。研究单核细胞与细菌相互作用的过程中，单核细胞释放的炎性相关细胞因子，对阐明SS2介导和调节炎症反应中具有一定的意义。
　　 本研究选择不同来源的具有不同毒力因子的SS2菌株与PK-15、HEp-2及PIEC细胞共孵育3h后，观察SS2菌株粘附细胞的能力。并通过建立SS2粘附因子的荧光定量PCR检测方法，对粘附试验所用菌株的粘附因子mRNA转录水平进行检测，以确定粘附因子转录水平是否影响细菌粘附细胞的能力。同时通过建立猪细胞因子IL-1β、IL-18、IL-8、IL-12和IL-10的荧光定量PCR检测方法，检测部分菌株刺激3D4猪肺泡巨噬细胞后上述细胞因子mRNA转录水平的变化。
　　 1.SS2对PK-15、HEp-2和PIEC细胞的粘附作用用1.0×107CFU SS2菌株分别与PK-15、HEp-2和PIEC等3种细胞孵育3h后，平板计数。结果表明不同菌株对同一种细胞的粘附能力不同，同一株细菌对3种细胞的粘附能力也不同。相关蛋白酶处理后的细菌可以减弱这种粘附作用。表明SS2具有粘附相关上皮细胞和内皮细胞的能力，且这种粘附能力与菌株和细胞类型均有关联。而细菌粘附能力强弱与细菌毒力强弱之间没有必然的关系。
　　 2.猪链球菌2型粘附因子SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及体外mRNA转录水平的检测根据已经报导的SS2相关粘附因子及管家基因aroA，以GenBank登录的核苷酸序列，设计特异性引物，经RT-PCR克隆和扩增了各粘附因子的核苷酸片段，构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性模板，建立检测各粘附因子SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。通过检测粘附试验中SS2各菌株粘附因子转录水平，初步阐明SS2粘附因子转录水平确实影响细菌粘附细胞的能力，为后续研究SS2粘附能力及致病机制提供研究平台。
　　 3.猪IL-1β、IL-18、IL-8、IL-10、L-12及β-actin SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及SS2对3D4猪肺泡巨噬细胞炎症相关细胞因子的体外mRNA转录分析依据GenBank中登录的各猪细胞因子及管家基因β-actin的核苷酸序列，设计特异性引物，经RT-PCR从3D4猪肺泡巨噬细胞系中克隆和扩增了上述三个因子的核苷酸片段，构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性模板(IL-8、IL-10及IL-12阳性质粒为本实验室构建保存)，建立了检测各细胞因子及β-actin SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。用建立的荧光定量PCR方法检测不同SS2菌株对3D4猪肺泡巨噬细胞系上述各细胞因子mRNA体外转录的影响。结果发现不同毒力、不同基因型的SS2菌株对细胞因子mRNA产生影响不同。