猪源益生菌复合制剂的开发及应用

摘要

近年来抗生素作为添加剂在饲料中得到广泛使用，在畜禽的防病和促生长的方面发挥着重要作用。但随之而来的是大量耐药菌株的产生、畜禽产品中药物残留等问题。实践和研究表明，益生菌是一种良好的抗生素替代品。地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis,Bl）和粪肠球菌（Enterococcus faecalis，Ef）可抑制病原微生物的生长，并产生多种营养物质，因此Bl和Ef可作为益生菌添加于饲料中。
　　本研究利用益生菌分离筛选的常规方法，分别得到具有良好益生特性的地衣芽孢杆菌B1和粪肠球菌NA14，对其生物学特性、细菌素和应用试验进行研究，实验表明两株菌株对断奶仔猪有防病和促生长作用。
　　1.猪源益生地衣芽孢杆菌与粪肠球菌的分离、鉴定及生物特性分析
　　从健康仔猪的肠道及粪便中分离得到3株芽孢杆菌和18株肠球菌。以肠道致病菌大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌C78-1为抗菌试验的指示菌株，其中芽孢杆菌菌株B1和肠球菌菌株NA1、NA3、NA4、NA10、NA14和NA18对指示菌有显著地抑制作用。综合培养特性、生理生化试验和16S rRNA序列分析鉴定方法，结果表明分离到的菌株B1为地衣芽孢杆菌，菌株NA4和NA14为粪肠球菌。进一步对上述菌株进行生物学特性研究，菌株B1能够耐受人工胃液2h和人工肠液2.5h，在0.3％胆盐12h和90℃15min作用下该菌株的存活率接近100％。菌株NA4和NA14在人工胃液中2h，细菌数量下降一个数量级，而人工肠液处理无影响;NA14耐胆盐能力比NA4强，可耐受0.3％胆盐;两者均能耐受60℃温度。
　　在菌株B1和菌株NA14的抗生素敏感试验中，发现菌株对常见的多种抗生素均敏感，仅对青霉素、金霉素和多粘菌素B表现出耐药性，可避免动物体内微生物之间抗生素抗性的转移。利用仔猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)检测B1和NA14的粘附性，粘附率分别为0.88％和8.7％，实验结果表明粪肠球菌具有较好的粘附能力。
　　2.菌株分泌抗菌物质的纯化和鉴定
　　菌株B1和NA14发酵液表现出广谱抗菌能力，两种发酵液对所列指示菌都有抑制作用。采用硫酸铵法对培养基上清中的抗菌物质进行纯化。B1细菌素具有良好的热稳定性和酸碱稳定性，100℃及以下处理30min抑菌活性未发生任何改变;在pH6-9之间活性维持稳定;在常见的蛋白酶中仅对蛋白酶K敏感;超滤管处理细菌素大小在3000-5000Da之间。NA14细菌素最高耐受温度为50℃，最佳pH为6-7，仅对蛋白酶K敏感，分子量在5000-10000Da之间。PCR方法检测B1和NA14细菌素的存在，结果表明NA14细菌素为enterocin A。
　　3.菌株B1和NA14的发酵工艺优化
　　在发酵基础培养基的基础上，分别对菌株B1和NA14的发酵条件和成分进行优化。B1菌株的最优发酵条件为初始pH值为6.5，8％接种量，30℃190r/min，最佳培养基配方:葡萄糖5％、牛肉膏20g/L、CaCl210g/L、MgSO45g/L。NA14菌株发酵条件为初始pH值为7.0，6％接种量，37℃180r/min，最佳培养基配方:蔗糖1％、牛肉膏20g/L、CaCl21g/L、MgSO41g/L。
　　4.益生菌的应用研究
　　试验选取杜长大三元杂交断奶仔猪（30日龄）160头，随机分为4组，分别饲喂金霉素（75mg/kg）、金霉素+地衣芽孢杆菌(75mg/kg+200亿CFU/g)、金霉素+粪肠球菌(75mg/kg+200亿CFU/g)、金霉素+地衣芽孢杆菌和粪肠球菌复合制剂（75mg/kg+地衣芽孢杆菌:150亿CFU/g，粪肠球菌:50亿CFU/g），连续饲喂30d。结果显示，益生菌各组在提高日增重、降低料肉比和腹泻率方面均好于抗生素组，但差异不显著;地衣芽孢杆菌和粪肠球菌抑制肠道大肠杆菌的生长，也能促使机体免疫力产生;综合评价复合菌制剂比单一菌株作用能力强。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 抗生素在养殖业中的使用状况

1．1 抗生素在养殖业中的使用误区

1．2 饲用抗生素的使用现状、面临问题

1．3 饲用抗生素替代品的研究进展

2 益生菌简介

2．1 益生菌的概念

2．2 益生菌的作用机理与益生作用

2．3 益生菌的筛选标准

2．4 影响益生菌使用效果的因素

2．5 益生菌当前存在的问题

3 益生菌芽孢杆菌的研究进展

3．1 芽孢杆菌的特点及其应用

3．2 益生芽孢杆菌的益生机制

3．3 益生地衣芽孢杆菌研究应用

4 益生肠球菌的研究进展

4．1 肠球菌在养殖业中的应用

4．2 肠球菌的耐药性

参考文献

第二章 益生芽孢杆菌和肠球菌的分离及鉴定

1 材料

1．1 动物样品

1．2 菌株

1．3 主要试剂

1．4 主要试剂及溶液的配制

2 方法

2．1 芽孢杆菌的分离及鉴定

2．2 肠球菌的分离及鉴定

3 结果与分析

3．1 芽孢杆菌的分离鉴定结果

3．2 肠球菌的分离鉴定结果

4 讨论

4．1 益生菌的分离筛选

4．2 益生菌的鉴定

5 小结

参考文献

第三章 地衣芽孢杆菌和粪肠球菌的生物特性研究

1 材料

2．1 地衣芽孢杆菌和粪肠球菌的抗逆性试验

2．2 地衣芽孢杆菌和粪肠球菌的抗生素敏感性试验

2．3 地衣芽孢杆菌和粪肠球菌粘附性试验

3 结果与分析

3．1．地衣芽孢杆菌和粪肠球菌的抗逆性能力

3．2 地衣芽孢杆菌和粪肠球菌的抗生素敏感性结果

3．3 粘附性试验

4 讨论

4．1 益生菌的抗逆性及粘附性

4．2 益生菌与抗生素的配伍使用

5 小结

参考文献

第四章 地衣芽孢杆菌和粪肠球菌抗菌物质的研究

1 材料

1．1 菌株

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

2．2 硫酸铵盐析法提取细菌素

2．3 温度稳定性测定

2．4 pH稳定性测定

2．5 蛋白酶稳定性测定

2．6 细菌素分子量预测

2．7 细菌素基因的鉴定

3 结果与分析

3．1 发酵液抑茵谱

3．2 硫酸铵提取细菌素

3．3 细菌素的热稳定性

3．4 细菌素pH稳定性

3．5 蛋白酶对细菌素的影响

3．6 细菌素分子量预测

3．7 细菌素基因组的PCR检测

4 讨论

4．1 细菌素的分类

4．2 细菌素的分离纯化

4．3 细菌素的抗茵谱

4．4 细菌素与抗生素的区别

5 小结

参考文献

第五章 地衣芽孢杆菌B1和粪肠球菌NA14发酵工艺初步研究

1 材料

1．1 菌种

1．2 培养基

2 方法

2．1 菌种活化

2．2 单因素发酵条件的优化

2．3 试验菌株生长曲线的测定

2．4 发酵培养基的优化

2．5 正交试验筛选培养基成分最佳比

3 结果与分析

3．1 单因素发酵条件优化结果

3．2 B1和NA14菌株生长曲线

3．3 发酵培养基优化结果

3．4 发酵培养基成分的正交试验

4 讨论

5 小结

第六章 猪源益生地衣芽孢杆菌和粪肠球菌制剂的应用

1 材料

1．1 微生态制剂

1．2 试验动物与场所

1．3 试剂

2 方法

2．1 试验动物分组与处理

2．2 生产性能检测及方法

2．3 收集样品及检测

2．4 数据处理

3 结果与分析

3．1 益生菌制剂对断奶仔猪生长性能的影响

3．2 腹泻率

3．3 仔猪粪便微生物的变化

3．4 断奶仔猪血液指标变化

4 讨论

4．1 益生菌对断奶仔猪生长性能及腹泻的影响

4．2 益生菌对断奶仔猪肠道茵群的影响

4．3 益生菌对断奶仔猪抗体水平的影响

5 小结

参考文献

全文总结

附录

攻读学位期间发表或完成论文

致谢