鸡四种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫程序及其稳定性试验

摘要

鸡球虫病是严重危害养禽业发展的重要疾病之一，危害比较严重的主要有柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫4个种，临床上往往为混合感染，因此研制抵抗这4种鸡球虫混合感染的多价疫苗显得十分迫切，本实验室已经构建了抵抗4种球虫的混合多价DNA疫苗和多价多表位DNA疫苗，初步显示了良好的免疫保护效果，为了比较球虫DNA疫苗和弱毒苗及抗球虫化学药物的保护效果以及进一步提高多价DNA疫苗的免疫保护效果，本研究比较了DNA疫苗、弱毒苗COCVAC和抗球虫化学药物地克珠利对单种球虫感染和多种球虫混合感染保护效果，对混合DNA疫苗的免疫程序和稳定性进行了研究。
　　 本研究第一部分用本实验室之前构建的5种重组质粒(pVAX1.0-TA4-IL-2、pVAX1.0-NA4-IL-2、 pVAX1.0-EM8-IL-2、 pVAX1.0-LDH-IL-2、 pVAX1.0-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2）、抗球虫化学药物地克珠利和弱毒苗COCVAC进行单种球虫感染和多种球虫混合感染的保护性比较试验。弱毒苗试验组按照使用说明在6日龄通过饮水进行免疫;DNA疫苗试验组在14日龄通过腿部肌肉注射分别接种相应的质粒，在21日龄加强免疫。在28日龄，除非免疫非攻虫组外，其余分别经口接种新鲜的E.tenella、E.necatrix、E.maxima、 E.acervulina和混合孢子化卵囊5×104个/羽、5×104个/羽、10×104个/羽、10×104个/羽、5×104个/羽。在攻虫的同时，地克珠利实验组按使用说明在饮水中添加地克珠利(1mg/L，连续给药3天)。7天后，剖杀所有试验鸡，对增重、每克肠道内容物卵囊数、肠道病变计分和抗球虫指数(ACI)等指标进行统计，检测其保护效果。结果发现，对于柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫以及混合攻虫（含柔嫩、毒害、巨型和堆型4个虫种），DNA疫苗的保护力均高于弱毒苗COCVAC和化学药物地克珠利;对于堆型艾美耳球虫，DNA疫苗的保护力高于弱毒苗COCVAC，但略低于化学药物地克珠利。
　　 本研究第二部分是将本实验室构建的免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-TA4-IL-2、pVAX1.0-NA4-IL-2、pVAX1.0-EM8-IL-2、pVAX1.0-LDH-IL-2按1∶1∶1∶1混合后进行免疫程序筛选，在此基础上再进行稳定性实验。主要包括以下几个方面:
　　 1.四种鸡艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫剂量的筛选将免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-TA4-IL-2、pVAX1.0-NA4-IL-2、pVAX1.0-EM8-IL-2、pVAX1.0-LDH-IL-2按1∶1∶1∶1混合后，分别以2μg、10μg、25μg、50μg、100μg、200μg免疫雏鸡，各剂量组分别以柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫攻虫。每个虫种分别设立非免疫攻虫对照组和非免疫非攻虫对照组，共29组。结果发现，柔嫩艾美耳球虫组免疫保护效果最好的免疫剂量为10μg，ACI为191.63。毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫免疫保护效果最好的免疫剂量均为25μg，ACI分别为177.31、168.84、165.49。
　　 2.鸡四种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫途径的筛选将混合DNA疫苗分别经肌肉注射、静脉注射、皮下注射、口服、滴鼻滴眼五个途径免疫雏鸡，各途径分别以柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫攻虫，每个虫种设立非免疫攻虫对照组和非免疫非攻虫对照组，共25组。结果发现，各免疫攻虫组中腿部肌肉注射组ACI均最高。其中柔嫩艾美耳球虫攻虫组ACI为162.89;毒害艾美耳球虫攻虫组ACI为179.54;巨型艾美耳球虫攻虫组ACI为174.94;堆型艾美耳球虫攻虫组ACI为167.10。腿部肌肉注射组免疫效果优于其他免疫途经组。
　　 3.鸡四种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫首免日龄及免疫次数的筛选本试验设计了一周龄首免不加强免疫组、一周龄首免二周龄加强免疫组、二周龄首免不加强免疫组和二周龄首免三周龄加强免疫组四个实验组，分别免疫混合DNA疫苗。各试验组分别以柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫攻虫，同时设立了非免疫攻虫对照组和非免疫非攻虫对照组，共21组。结果发现，加强免疫组比非免疫组免疫保护效果好，除毒害艾美耳球虫攻虫组外，所有加强免疫组的ACI都大于160;二周龄首免组比一周龄首免组免疫保护效果好，二周龄首免三周龄加强免疫组效果最好。
　　 4.鸡四种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫稳定性实验将混合DNA疫苗在不同的温度(-20℃、4℃和室温)下分别保存1个月、3个月、6个月，分别免疫雏鸡。各温度组分别以柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫攻虫，同时设立非免疫攻虫对照组和非免疫非攻虫对照组，共41组。结果发现，绝大多数免疫组的ACI都大于160，说明各保存条件下混合DNA疫苗都具有免疫保护效果，且在三个不同温度和不同保存时间内能保持相对稳定性。

目录

论文说明

声明

摘要

前言

第一章 鸡球虫病的免疫研究进展

1 鸡球虫的生活史

2 鸡抗球虫感染免疫特点

2．1 球虫的免疫原性

2．2 非特异性免疫

2．3 特异性免疫

3 鸡四种常见艾美尔球虫重要保护性抗原的研究进展

3．1 柔嫩艾美耳球虫

3．2 毒害艾美耳球虫

3．3 堆型艾美耳球虫

3．4 巨型艾美耳球虫

4 展望

参考文献

第二章 鸡球虫DNA疫苗研究进展

1 DNA疫苗的研究史

2 DNA疫苗的免疫机理

3 DNA疫苗的特点

4 鸡球虫DNA疫苗研究进展

5 影响鸡球虫DNA疫苗免疫效果的主要因素

5．1 免疫途径

5．2 免疫剂量

5．3 免疫次数

6 细胞因子佐剂在鸡球虫DNA疫苗中的应用

7 展望

参考文献

第三章 鸡球虫DNA疫苗和弱毒苗COCVAC及化学药物地克珠利保护效果的比较

1 试验材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 试验结果

2．1 增重影响

2．2 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的肠道病变的影响

2．3 DNA疫苗免疫对鸡球虫感染的卵囊计数的影响

2．4 抗球虫指数统计结果

3 讨论

参考文献

第四章 鸡四种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫剂量筛选

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果

2．1 增重影响

2．2 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的卵囊计数的影响

2．3 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的肠道病变的影响

2．4 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的抗球虫指数

3 讨论

参考文献

第五章 鸡四种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫途径筛选

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 增重影响

2．2 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的卵囊计数的影响

2．3 免疫鸡对球虫感染的肠道病变的影响

2．4 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的抗球虫指数

3 讨论

参考文献

第六章 鸡四种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫首免日龄及免疫次数筛选

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 增重影响

2．2 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的卵囊计数的影响

2．3 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的肠道病变的影响

2．4 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的抗球虫指数

3 讨论

参考文献

第七章 鸡四种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫稳定性试验

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 对增重的影响

2．2 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的卵囊计数的影响

2．3 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的肠道病变的影响

2．4 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的抗球虫指数

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢