小麦TaSSP1基因的克隆、原核表达及生理功能初步鉴定

摘要

本实验室在研究小麦叶片衰老过程中蛋白水解酶同工酶的变化时，发现一种了性质较为稳定的蛋白酶。进而纯化了该蛋白酶，并通过质谱鉴定以及对所得数据在NCBI数据库中比对，结果显示其属于枯草杆菌类(subtilisin-like)丝氨酸型蛋白酶，因此命名为TaSSP1(Triticum aestivum Subtilisin-like Serine Protease1);随后，通过对该蛋白酶抗原性分析，以其mRNA序列设计兼并引物，克隆到了与该蛋白酶抗原性相关的718bp基因片段(Triticum aestivum Subtilisin-like Serine Protease1-fragment，TaSSP1-f).接着，在此基础上，成功地在大肠杆菌中表达了该基因片段的蛋白产物，并制得了该蛋白酶片段的抗血清.近期，通过RACE(rapid amplification of cDNA ends)方法，成功获得了该蛋白酶基因的全序列，该序列全长为2361bp。
　　 本论文工作在上述研究基础上，首先，对去除信号肽的TaSSP1全基因序列以及其不同结构域的基因序列进行了原核表达，获得该蛋白酶的不同蛋白片段，然后通过活性分析等研究，以期阐明该蛋白酶激活的结构学机制。其次，分别从核酸和蛋白水平对小麦体内该蛋白酶的表达情况进行分析鉴定，以期进一步明确该蛋白酶的生理功能。
　　 通过Signa14.0软件分析，知道上述蛋白酶序列的前27个氨基酸序列是该蛋白的信号肽区域。然后，将去除信号肽的TaSSP1基因重组到表达载体pET24b上，成功构建了pET24b-TaSSP1-31-786重组表达质粒，并将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta中诱导表达，诱导条件:温度30℃，时间3h， IPTG浓度为0.5 mM。在菌液OD600值为0.8左右时，超声破碎菌体后通过SDS-PAGE电泳检测发现菌液中诱导表达的蛋白分子量（约56KD）比理论蛋白的分子量(78KD)要小。而western-blot检测发现，诱导表达的蛋白可以和本实验室制备的该蛋白酶片段抗血清进行免疫结合。同时根据该蛋白酶不同结构域的基因序列结构，分别构建了pET24b-TaSSP1-133-450，pET24b-TaSSP1-133-786两个重组质粒，并按照上述相同方法转入大肠杆菌Rosetta中诱导表达，相同条件下超声破碎菌体后通过SDS-PAGE电泳检测，但结果均未发现表达的预期相应蛋白。
　　 在TaSSP1基因生理功能的研究中，实验材料为扬麦158，小麦生长采用定期灌浇Hoagland营养液的水培方式，在小麦长至15天时，营养液中分别加入10μM脱落酸ABA(Abscisic Acid)与22μM6-苄氨基嘌呤6-BA(6-Benzyl Aminopurine)对小麦进行处理。然后取不同处理时间的小麦叶片（仅取小麦第三片叶），提取RNA，采用半定量和荧光定量RT-PCR两种方法分析在不同的激素和不同时间处理下，小麦TaSSP1在转录水平上表达量的变化。结果显示，在ABA处理条件下，随着处理时间的增加从0h、1h、3h、到7h，TaSSP1基因在RNA水平的表达有逐渐增加的趋势，然后恢复到天然水平;而在6-BA处理下，在处理的72h内，除1h外，随着处理时间的增加，TaSSP1基因的RNA表达水平呈现逐渐下降趋势。
　　 同样条件下取不同激素和不同时间处理的小麦叶片，提取小麦叶片的粗酶液为样液，分别采用SDS-PAGE和Western-blot方法，检测了小麦枯草杆菌类丝氨酸型蛋白酶TaSSP1蛋白水平表达的变化情况。结果显示，在ABA处理后的0到12h时，小麦TaSSP1基因在蛋白水平上的表达量呈现增加趋势，而后到72h内一直保持比对照高的水平;而6-BA处理后的0h到7h内，小麦TaSSP1基因在蛋白水平上的表达量呈现逐渐降低的趋势，而后的72h内一直保持在比对照低的水平上。
　　 在小麦长至15天时，取去除其两端的小麦第三片叶，暗处理1、2、3和4天后，进行Western-blot和含明胶的5％-15％浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定，结果显示，随着暗处理时间的增加，小麦叶片TaSSP1的活性逐渐增强，并伴随着Rubisco的逐渐减少;分子量为78KD的TaSSP1会逐渐降解为分子量约为71KD、66KD、57KD的片段，其中，71KD片段的量逐渐减少，而57KD的片段的量逐渐增加;71KD、66KD的片段是TaSSP1的活化中间体，而57KD的片段为降解片段，不表现酶活性。

目录

声明

摘要

缩略词对照表

文献综述

一 植物体内蛋白水解酶

1．1 植物体内蛋白水解酶的分类

1．2 枯草杆菌类蛋白酶

二 内肽酶的研究方法

2．1 蛋白水平上内肽酶的研究方法

2．2 基因水平上内肽酶的研究方法

三 研究目的和意义

第一章 小麦TaSSP1基因的克隆与表达

1 研究背景

2 实验材料

2．1 植物材料

2．2 菌株与载体

2．3 试剂

2．4 溶液配置

2．5 仪器

3 实验方法

3．1 PCR获得各目的片段

3．2 琼脂糖凝胶产物的回收

3．3 目的片段与pMD19-T载体的连接

3．4 超级感受态细胞的制备

3．5 重组质粒转化

3．6 T-A克隆的鉴定

3．7 目的片段与表达载体相连

3．8 重组质粒的鉴定

3．9 诱导表达

4．实验结果

4．1 TaSSP1结构分析

4．2 PCR获得各目的片段的鉴定

4．3 T-A克隆的鉴定

4．4 目的片段与表达载体相连

4．5 诱导表达的结果与分析

4．6 重组蛋白在菌体中的主要存在形式及纯化

4．7 明胶-聚丙烯酰胺凝胶活性电泳检测蛋白酶活性

5 本章小结

6本章讨论

第二章 小麦TaSSP1基因生理功能的初步研究

1 前言

2 材料

2．1 植物材料及处理

2．2 试剂与溶液配制

2．3 仪器

3 实验方法

3．1 半定量RT-PCR分析不同激素不同时间处理下TaSSP1基因的表达

3．2 实时荧光定量PCR分析不同激素不同时间处理下TaSSP1基因的表达

3．3 Western-blot分析不同激素不同时间处理下小麦TaSSP1基因在蛋白水平的表达

3．4 蛋白酶活性检测

4 结果分析

4．1 电泳检测RNA质量

4．2 半定量RT-PCR分析不同激素和不同时间处理下叶片TaSSP1基因转录本的变化

4．3 实时荧光定量PCR分析不同激素不同处理下叶片TaSSP1基因转录本的变化

4．4 Western-blot分析不同激素不同时间处理下小麦TaSSP1基因在蛋白水平上的变化

4．5 暗处理小麦叶片TaSSP1的Western-blot及活性电泳检测

5．本章小结

6．本章讨论

全文总结

创新之处

存在问题和展望

参考文献

致谢