棉花不成熟纤维突变基因(im)的定位及突变体纤维次生壁加厚期表达谱分析

摘要

棉花是重要的经济作物。棉纤维是重要的天然纺织原料。它是由胚珠表皮细胞发育而来的单细胞绒毛。棉纤维的发育可以分为四个明显不同但略有重叠的阶段:纤维的分化和起始、细胞伸长、次生壁合成和纤维成熟。由于棉纤维在发育过程中表现出的优良特性，被认为是研究细胞伸长和细胞壁生物合成的理想模型。突变体是进行遗传研究和揭示重要基因分子机制的优良材料。不成熟纤维突变体im是棉花中一个特殊的纤维突变体，被认为引起次生壁发育缺陷。对im突变体的研究将有助于我们更好地理解纤维次生壁发育的复杂过程，揭示其分子调控机理，并为棉花纤维品质改良贮备一些优良基因。本研究以im突变体为研究材料，开展了棉花不成熟纤维突变基因对纤维主要品质和衣分性状影响研究，以及与其相关的棉纤维次生壁表达谱分析。主要研究结果如下:
　　 1.通过比较im突变体和2个陆地棉纤维发育正常品系TM-1和I4005的纤维表型，发现与对照材料相比，棉纤维在im突变体中不蓬松，仍紧缩在种子上。进一步配置im×TM-1和im×I4005杂交组合，发现所有的F1植株均表现正常蓬松的纤维表型，而F2群体中出现紧缩和正常蓬松2种纤维表型，分离比例符合孟德尔单基因遗传规律。证实im突变体是由一对隐性等位基因控制。
　　 2.利用6713对SSR引物对im突变体和I4005及TM-1进行全基因组扫描。在im突变体和I4005之间共找到257个多态性标记。其中186个SSR标记产生193个多态性位点，分布在31个连锁群上。im基因座和4个SSR标记NAU1190，DPL0170，NAU3995和NAU1197位于同一条连锁群上。该连锁群属于棉花3号染色体(A3)，覆盖55.5 cM，标记间平均距离为13.9 cM。im基因座两侧最近的标记为DPL0170和NAU3995，分别相距21.8 cM和32.5 cM。im突变体和TM-1之间仅发现3个位于A3染色体上的多态性标记，NAU3639，NAU1190和DPL0170，它们分别与im基因座相距10.2、24.3和23.3 cM。
　　 3.为了进一步精细定位im基因，为图位克隆该基因奠定基础。利用以TM-1为背景携带海岛棉海7124A3染色体片段的3个染色体单片段代换系(CSILs)，CSIL028、CSIL030和CSIL031与im突变体杂交，构建了CSIL028×im F2，CSIL030×im F2和 CSIL031×im F2作图群体。使用棉花公共遗传图谱A3连锁群上的SSR标记在这3个F2群体中分别检测到47、7和12个SSR多态性标记。其中，以CSIL028×im F2为作图群体构建的遗传图谱最为密集，47个SSR标记联同im基因座覆盖80.9 cM，平均标记间距离1.8 cM。im基因被定位于BNL2443和cgr6528标记之间，分别相距3.6和1.3 cM。在以CSIL030×im F2和CSIL031×im F2为作图群体构建的遗传图谱中发现只有单侧标记与im基因座连锁，最近的标记NAU5444和NAU3479分别与im基因座相距30.3 cM和40.0 cM。同时连锁分析显示CSIL030和CSIL031中所导入的海7124A3染色体片段上不包含im等位基因。
　　 4.通过比较im突变体与I4005、TM-1、CSIL028、CSIL030及CSIL031在纤维品质及衣分上的差异，发现除了短纤维指数im突变体显著高于其他5个材料外，在纤维长度、比强度、马克隆值、成熟度、整齐度和衣分等多个性状上，im突变体均显著的低于其他5个材料(P＜0.001)。对5个F2(:)3群体的QTL分析显示，每个群体中均有多个性状相关的QTL成簇分布在im基因座周围，解释的表型变异从18.2％～82.03％。利用BioMercator v2.1对这5个群体QTL的meta分析显示，除了纤维比强度之外，和其他6个性状相关的成簇分布在im基因座周围的QTL均分别是一个一致性QTL。这6个一致性QTL被定位在一个很小的区间内，它们95％的置信区间分别为1.22、0.72、0.56、0.89、0.76和0.67 cM，两侧最近的标记均为BNL2443和cgr6528，解释的平均表型变异为27.16‰69.61％。
　　 5.通过检测im突变体和TM-1在19、22、25、30、35、40 DPA和成熟期7个纤维不同发育时期的纤维素含量，结果显示，在每个对应的发育时期，im突变体棉纤维中纤维素含量均显著低于TM-1。推测im突变体中纤维素的合成可能受到部分抑制。对两个材料13、19、25 DPA及成熟纤维细胞壁厚度的比较发现，im突变体25 DPA及成熟纤维的细胞壁厚度显著低于TM-1，表明im突变体次生壁发育缺陷，而细胞壁厚度减小可能是由于纤维素减少所导致的。对10、13、16、19、22、25、30、35、40DPA纤维中葡萄糖、果糖和蔗糖含量的分析发现，im突变体和TM-1中葡萄糖和果糖变化趋势非常相似，但在次生壁发育后期im突变体纤维中的葡萄糖和果糖含量更高。在25～35 DPA期间TM-1纤维细胞中的蔗糖含量显著高于im突变体。这可能与im突变体和TM-1中不同的纤维素含量相关。推测在次生壁发育阶段，由于im基因突变影响了纤维细胞中正常的糖代谢过程，im突变体中分配进入纤维素合成途径的蔗糖可能少于TM-1。
　　 6.利用包含29，184个纤维发育相关探针的cDNA芯片对im突变体和TM-1在13、16、19、22和25 DPA不同纤维发育时期以及材料间的表达谱进行比较分析。对相邻时间点的基因差异表达比较显示，13～16，16～19，19～22 DPA相邻时间点中在TM-1中的差异表达基因（foldchange＞2倍，FDR＜0.05）数目均高于im突变体。特别是在纤维发育的13～16 DPA阶段，在im突变体中仅检测到98个差异基因，而在TM-1中检测到494个。但在纤维发育22～25 DPA中则刚好相反，在im突变体中检测到更多的差异表达基因。在im突变体中检测到236个差异表达基因，而在TM-1中仅检测到60个。表明两个材料在相同的发育阶段表现不同的基因表达变异水平，而im突变体前低后高的基因表达变异水平则暗示其可能存在纤维发育的延迟性。TM-1和im突变体之间基因表达水平变化最大的时期发生在16 DPA，一共有1308个基因差异表达。表明16 DPA是一个非常重要的纤维发育时期。进一步对差异表达基因的GO功能注释及富集分析显示，和im突变体相比TM-1更早的启动了纤维次生壁的合成，大致在16 DPA，而im突变体则直到19 DPA才开始启动次生壁的合成。在16和19DPA，次生壁合成的起始阶段，TM-1和im突变体间差异表达基因中富集到的GO大部分涉及糖代谢及细胞壁合成相关进程。涉及这些进程的部分基因与拟南芥中被证实是次生壁正常发育所需的基因相似。和im突变体相比，它们在这个阶段的TM-1纤维中具有更高的转录水平。然而在随后的纤维发育时期中，这些与糖代谢及细胞壁合成相关的进程没有被富集，暗示im基因可能更多的作用于次生壁发育的早期阶段，它很可能是一个参与调节细胞内碳流进入纤维素合成的调控基因。
　　 7.利用最近释放的棉花D基因组序列信息，结合im基因定位结果，在包含im基因的区域内预测到了155个基因。根据表达谱分析结果，155个基因中仅检测到8个在TM-1和im突变体之间差异表达，但基因表达水平差异并不很大。GO分析显示有73个基因参与到不同的生物进程，其中有20个基因参与到信号、生物调控、生长发育、再生及糖代谢相关进程。但这些基因并没有在芯片表达谱分析中检测到在TM-1和im突变体之间存在表达差异，这可能与芯片中代表的基因数有关。KEGG分析显示有18个基因参与到不同的代谢途径，其中糖代谢是最主要的代谢途径。这些基因在纤维发育中扮演的角色，确切的im基因的克隆及功能分析还需要进一步实验验证。

目录

声明

摘要

本文所用主要缩略词

第一章 棉花分子标记定位研究进展

1 DNA分子标记技术的发展

2 遗传图谱的作图群体

3 棉花分子遗传图谱研究进展

3．1 棉花种间分子遗传图谱研究进展

3．2 陆地棉种内分子遗传图谱研究进展

3．3 二倍体棉花分子遗传图谱研究进展

4 棉花质量性状定位研究进展

5 QTL定位方法研究进展

6 棉花纤维品质及产量QTL定位研究进展

第二章 棉纤维发育研究进展

1 棉纤维发育概述

2 棉纤维的发育特征、机制与重要基因纤维的分化和起始期

2．1 纤维的分化和起始期

2．2 棉纤维细胞伸长期

2．3 次生壁合成期

2．4 脱水成熟期

第三章 棉纤维发育转录组研究进展

1 棉花EST数据库

2 转录组学的主要研究方法

2．1 基于微阵列技术的表达谱分析手段

2．2 基于测序技术的表达谱分析手段

3 棉纤维发育转录组学研究进展

3．1 微阵列技术在棉纤维转录学研究上的应用

3．2 测序技术在棉纤维转录学研究上的应用

本研究的目的与意义

第四章 棉花不成熟纤维突变基因(im)的定位及其对纤维品质性状及衣分的影响

1 材料与方法

1．1 实验材料及群体构建

1．2 性状调查

1．3 纤维品质测定

1．4 棉花DNA的提取

1．5 SSR分析

1．6 数据分析

2 结果与分析

2．1 im突变体的遗传分析

2．2 群体分子标记基因型的分析和遗传图谱的构建

2．3 亲本及作图群体纤维品质及衣分性状统计分析

2．4 纤维品质及产量性状QTL检测及Meta分析

3 讨论

3．1 棉花种内与种间遗传多态性

3．2 CSILs在基因定位和QTL检测中的作用

3．3 im基因对纤维品质及衣分性状的影响

第五章 棉花不成熟纤维突变体纤维次生壁加厚期表达谱分析

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 葡萄糖、果糖及蔗糖含量测定

1．3 棉纤维纤维素含量测定

1．4 棉纤维细胞壁显微观察与细胞壁厚度测定

1．5 RNA提取和纯化

1．6 RNA样品标记探针

1．7 cDNA芯片杂交

1．8 统计分析

1．9 定量PCR分析

2 结果

2．1 棉纤维中纤维素含量和细胞壁厚度分析

2．2 纤维发育进程中葡萄糖、果糖及蔗糖含量变化

2．3 im突变体和TM-1在纤维发育进程中的表达谱变化

2．4 相邻时期差异表达基因的GO功能注释与富集分析

2．5 im突变体和TM-1差异表达基因的GO功能注释与富集分析

2．6 参与次生壁合成的碳水化合物活性酶基因分析

2．7 转录因子分析

2．8 差异表达基因的定量验证

2．9 im候选基因预测分析

3 讨论

3．1 im基因对次生壁发育的影响

3．2 TM-1和im突变体具有不同步的纤维发育进程

3．3 糖代谢与次生壁合成进程

3．4 转录因子

3．5 im候选基因

全文结论

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表及待发表论文