猪圆环病毒2型单克隆抗体研制与夹心ELISA抗原检测方法的建立

摘要

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起世界养猪国家经济损失的重要病原之一。PCV2感染与临床多种综合征疾病有关，这些疾病被统称为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)或猪圆环病毒病(PCVD)。PCV2是一个无囊膜单股环状DNA病毒，PCV2基因组上有4个开放性阅读框ORF1～4，其中ORF1～3编码病毒非结构蛋白，ORF2编码病毒结构蛋白，即Cap蛋白。Cap蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白，在抗病毒感染免疫中发挥着重要作用。本研究以纯化的PCV2病毒粒子为免疫原，成功筛选出针对PCV2Cap蛋白单克隆抗体，并利用其中的一株单抗和制备的兔多抗血清建立了检测PCV2的夹心ELISA抗原检测方法，为PCV2诊断和病毒蛋白功能研究提供了重要工具。本研究的具体内容如下:
　　1.PCV2单克隆抗体的制备与鉴定
　　本研究利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫Balb/c小鼠，通过单克隆抗体技术，筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3E5、3E6和5A6。体外培养连续传代至第20代，分泌抗体的效价基本一致。3E5、3E6和5A6培养的上清效价分别为1∶12800、1∶1600和1∶6400，腹水效价为1∶6400000、1∶640000和1∶800000;3株单抗亚类与型鉴定，重链均为IgG2a亚类，轻链为κ型;间接免疫荧光试验结果显示，3株单抗均可与PCV2产生特异性荧光反应;病毒中和试验显示，3E5和3E6均具有良好的中和活性，而5A6不具有中和活性;Westernblot结果表明，3株单抗均可与PCV2Cap蛋白（约30kDa）发生特异性反应，其识别的表位需要Cap蛋白N端42～50aa区域某些氨基酸的参与。这些单抗的制备为PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段。
　　2.PCV2夹心ELISA抗原检测方法的建立与初步应用
　　本研究利用PCV2单克隆抗体3E5作为捕获抗体，兔抗PCV2血清为第一抗体，成功建立了PCV2夹心ELISA抗原检测方法，其优化的反应条件为:单抗包被浓度为2μg/mL，37℃包被2h;用含5％脱脂乳的磷酸盐缓冲液封闭，37℃作用1h;待检抗原稀释度应在1∶2以上，37℃作用2h;兔抗PCV2血清1∶8000稀释，37℃作用1h;羊抗兔IgG-HRP稀释度1∶10000，37℃作用0.5h;TMB显色时间为37℃作用10min。判定标准为:样品的OD450nm值≥0.209时为阳性，样品OD450nm值＜0.191时为阴性，介于0.191～0.209之间为可疑。该ELISA方法与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪巨细胞病毒(PCMV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)及副猪嗜血杆菌(Hps)等均无交叉反应性。检测PCV2细胞毒，其最低检测下限为102.59TCID50/mL;批内和批间试验显示其变异系数均小于10％，说明该ELISA方法具有较高特异性、敏感性和重复性。采用倍比稀释PCV2标准样品绘制病毒抗原定量检测的标准曲线，检测范围为390.6～25000TCID50/mL，相关系数r值为0.99。应用该方法定量检测6份细胞毒样品中PCV2含量，结果与间接免疫荧光法测得的病毒TCID50相似;该方法与经β-丙内酯灭活的PCV2细胞毒、真核表达的PCV2Cap蛋白均可有效反应，但不能与甲醛灭活的PCV2抗原反应。用该方法检测临床发病猪淋巴结组织样品中PCV2含量，发现仔猪表现PMWS的临床症状与其组织中PCV2的病毒含量有明显的正相关性。以上结果表明该方法在应用于PCV2含量检测和PCVAD诊断方面，具有重要应用前景。
　　综上所述，本文筛选到单克隆抗体与PCV2反应性良好，可以应用于Westernblot、IFA和病毒中和试验中作为PCV2抗原的诊断试剂。建立的检测PCV2的夹心ELISA抗原检测方法，具有较好的特异性、敏感性、重复性。这些抗体的制备和ELISA方法的建立为今后PCVAD的诊断和流行病学调查提供了有用方法。

目录

声明

摘要

第一章 猪圆环病毒2型及其诊断方法研究进展

1 PCV2研究概述

1．1 病毒分类地位

1．2 病毒形态学及理化特性

1．3 基因组结构及编码蛋白

1．4 PCV2感染及猪圆环病毒病

2 猪圆环病毒病诊断方法

2．1 病原学方法

2．2 血清学方法

2．3 单克隆抗体研究进展

参考文献

第二章 猪圆环病毒2型单克隆抗体的制备与鉴定

1 材料与方法

1．1 细胞、毒株、实验动物及试剂

1．2 免疫原的制备

1．3 小鼠免疫

1．4 免疫小鼠抗体效价的测定

1．5 细胞融合

1．6 杂交瘤细胞株的建立

1．7 杂交瘤细胞的冻存与复苏

1．8 单克隆抗体腹水的制备

1．9 单克隆抗体的鉴定

2 结果

2．1 病毒纯化

2．2 免疫小鼠抗体效价测定

2．3 杂交瘤细胞株的建立

2．4 单克隆抗体的鉴定

2．5 单抗表位的初步鉴定

3 讨论

参考文献

第三章 猪圆环病毒2型夹心ELISA抗原检测方法的建立与初步应用

1 材料与方法

1．1 动物、毒株及试剂

1．2 单克隆抗体的制备与纯化

1．3 兔抗PCV2抗体的制备及鉴定

1．4 阴阳性检测样品的制备

1．5 夹心ELISA抗原检测方法的建立及优化

1．6 判定标准的确定

1．7 特异性试验

1．8 敏感性试验

1．9 重复性试验

1．10 标准曲线的建立

1．11 夹心ELISA与IFA两种定量检测方法的比较

1．12 夹心ELISA方法的初步应用

2 结果

2．1 单抗纯化

2．2 兔抗PCV2血清抗体的制备与鉴定

2．3 阴阳性对照样本的检测

2．4 夹心ELISA方法的建立与反应条件优化

2．5 判定标准的确定

2．6 特异性试验

2．7 敏感性试验

2．8 重复性试验

2．9 标准曲线的建立

2．10 夹心ELISA与IFA两种定量检测方法的比较

2．11 夹心ELISA初步应用

3 讨论

参考文献

全文总结

附录 常用试剂的配制

致谢