菊花转录因子CmbHLH1的克隆及功能鉴定

摘要

菊花栽培历史悠久，花色丰富，形态多样，是我国十大传统名花和世界四大切花之一，在花卉产业中占有重要地位。转录因子是在基因表达调控过程中起重要作用的蛋白分子，与植物胚的发生与发育、植株生长、细胞分化、形态建成、植物抗性、营养吸收等生命活动都密切相关，是国内外研究的热点之一。bHLH转录因子蛋白因其具有独特的HLH结构域而被分为一类，该类转录因子参与植物生长发育的诸多过程，如色素的合成调控、金属离子吸收、光形态建成等。为此，本研究克隆了菊花bHLH转录因子基因CmbHLH1及其启动子序列，对其组织器官、响应外源生长调节物质及非生物胁迫的表达特性进行了分析，并通过转化菊花‘神马’初步进行了功能鉴定。主要结果如下:
　　本研究利用RT-PCR和RACE等技术克隆了菊花‘钟山紫桂’bHLH转录因子基因的cDNA全长，命名为CmbHLH1。CmbHLH1全长987bp，开放阅读框(ORF)为630bp，编码210个氨基酸，其编码产物含有典型的HLH保守结构域。氨基酸序列比对发现，CmbHLH1与苹果bHLHdomainclasstranscriptionfactor(ADL36593)同源性最高，达到62.98％。系统进化树分析表明，CmbHLH1和拟南芥ILR3(NP_200279.1)的亲缘关系比较近。启动子序列顺式作用元件预测分析显示，除具有典型的真核生物核心启动子结构外，还包含多个与胁迫响应和激素应答有关的调控元件，如IDE2、IBOXCORE、MYCCONSENSUSAT、WEKY710S等。
　　荧光定量PCR（qRT-PCR）显示，在低铁离子胁迫处理12h后，‘钟山紫桂’根中CmbHLH1表达水平升高，约在48h时达到最高。在100mg/LABA处理24h内，处理组的CmbHLH1表达量均高于对照组，而在0.5mmol/LSA处理24h内，处理组的CmbHLH1表达量均低于对照组。在MeJA处理与其他非生物胁迫下，处理组的CmbHLH1表达量较对照组没有明显的大幅变化。
　　本研究还构建了CmbHLH1基因植物正反义表达载体，用农杆菌介导的叶盘转化法将CmbHLH1基因转化菊花‘神马’。经潮霉素筛选，鉴定出21个抗性株系，其中14个转正义载体株系，7个转反义载体株系。基因定量分析选取出了2个超表达株系(35S∷(+)CmbHLH1-1和35S∷(+)CmbHLH1-2)与2个低表达株系(35S∷(-)CmbHLH1-1和35S∷(-)CmbHLH1-2）。对以上4个株系以及未转基因植株进行缺铁离子胁迫处理与根系pH检测。根系中铁、锌、锰离子含量测定表明，超表达CmbHLH1基因能促进根系对铁离子的吸收，而对锰、锌的作用不明显。pH检测结果表明超表达株系能够显著提高根系酸化能力。综上所述，推断该转录因子CmbHLH1可能参与调控菊花对铁离子的吸收。

目录

声明

摘要

缩略词表

引言

第一章 文献综述

1 铁的吸收与运输

1．1 铁离子感受器

1．2 铁离子的吸收机制

1．3 铁离子的运输与存储

1．4 铁离子信号调节因子

2 bHLH转录因子研究进展

2．1 bHLH转录因子的结构

2．2 bHLH转录因子的分类

2．3 bHLH转录因子的功能

3 本研究的目的意义

第二章 菊花CmbHLH1基因及其启动子的克隆与序列分析

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 试剂与仪器

1．3 实验方法

2 结果与分析

2．1 RNA提取质量与反转录效果检测

2．2 CmbHLH1基因的克隆

2．3 CmbHLH1基因的序列特征

2．4 CmbHLH1基因系统进化树的构建

2．5 CmbHLH1基因启动子序列分析

3 讨论

第三章 菊花CmbHLH1基因的表达调控与功能鉴定

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 试剂与仪器

1．3 实验方法

2 结果与分析

2．1 CmbHLH1组织器官表达特异性

2．2 缺铁离子胁迫下CmbHLH1的表达特性

2．3 外源生长调节剂及非生物胁迫下CmbHLH1的表达特性

2．4 CmbHLH1表达载体的获得

2．5 CmbHLH1转基因植株的获得与检测

2．6 根系铁、锌、锰离子含量与pH检测

3 讨论

全文结论

创新点

参考文献

附录

攻读学位期间发表的论文

致谢