广东部分地区犬流感血清流行病学调查及病毒的分离鉴定

摘要

犬流感是由犬流感病毒(Canine influenza virus，CIV)引起的一种高度接触性、传染性呼吸道疾病。已经证实有马源H3N8和禽源H3N2亚型流感病毒可以造成犬的感染，并引起犬的种内传播。犬与人类接触密切，目前尚不清楚流感病毒是否可以通过犬传染给人。因此，对犬流感的流行病学调查扣病毒的监测具有重要公共卫生意义。
　　研究利用血凝抑制试验对来源于广东省的309份犬血清样本进行H3亚型流感病毒抗体检测，总体阳性率为26.21％。对不同类型、不同区域的犬抗体阳性率进行比较，结果显示宠物犬、农家犬及流浪犬的抗体阳性率分别为34.02％、9.09％和25.93％，个别地区的阳性率超过50％。说明H3亚型犬流感已在犬群中流行，并且与近年的调查结果相比呈上升趋势。
　　采集广东地区29份有呼吸道症状犬的鼻拭子，接种鸡胚分离病毒，并进行亚型鉴定和序列分析。分离获得2株H3N2亚型犬流感病毒，分别命名为A/canine/Guangdong/12/2012(H3N2)及A/canine/Guangdong/23/2012(H3N2)。根据参考毒株的基因序列设计特异性引物，用RT-PCR的方法分别扩增两株病毒的8个基因片段，克隆入pMD-19T载体进行基因测序，并构建基因进化树。结果显示分离病毒的8个片段与韩国禽源犬、猫流感毒株、泰国分离株以及广东、江苏、北京、浙江、辽宁分离株的基因同源性均较高，达到98％-99％，与泰国2012年分离株在演化关系上最为接近。氨基酸比对显示HA的裂解位点、抗原位点、受体结合位点及潜在糖基化位点与禽源株相比均有突变。NA抗原位点也有突变，并在颈部有氨基酸插入。其中分离株A/canine/Guangdong/12/2012(H3N2)较独特，颈部只有一个氨基酸插入，与以往犬流感病毒中国分离株不同。
　　为了建立针对多种亚型犬流感病毒的检测方法，选取犬流感病毒中保守的核蛋白(NP)基因，克隆至pET-32a载体，在大肠杆菌中诱导表达，然后进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果显示，NP蛋白获得成功表达，重组NP蛋白分子量为66ku，且与CIV全病毒抗血清可发生特异性反应，表明该蛋白具有良好的反应原性。重组NP蛋白的表达，为建立犬流感抗体ELISA检测方法提供了物质基础。
　　上述研究为进一步探讨犬流感病毒的生物学特征和传播机制奠定基础，并为有效检测、科学防控犬流感提供参考依据。

目录

声明

摘要

缩略语及符号

第一章 文献综述

1 流感病毒的病原学特征

1．1 流感病毒的结构与理化特性

1．2 病毒的分类

1．3 增殖特性

1．4 血凝特性

1．5 分子特征

2 犬流感流行病学研究进展

2．1 H3N8亚型犬流感

2．2 H5N1亚型犬流感

2．3 H1N1亚型犬流感

2．4 H3N2亚型犬流感

2．5 其他亚型犬流感

3 犬流感检测方法研究进展

3．1 血清学检测

3．2 病原学检测

4 犬流感的危害与公共卫生意义

参考文献

第二章 H3亚型犬流感的血清流行病学调查

1 材料与方法

1．1 犬血清样本的收集

1．2 菌株与血清

1．3 材料

1．4 血清处理

1．5 血凝与血凝抑制试验

2 结果

2．1 样品来源与总阳性率

2．2 宠物犬、农家犬、流浪犬H3亚型抗体阳性率比较

2．3 不同区域宠物犬H3亚型CIV抗体检测

2．4 不同区域农家散养犬H3亚型CIV抗体检测

3 讨论

参考文献

第三章 犬流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析

1 材料与方法

1．1 样品与实验动物

1．2 主要试剂与仪器

1．3 引物设计与合成

1．4 CIV的分离与鉴定

1．5 全基因序列测定及遗传演化关系分析

2 结果

2．1 病毒分离与初步鉴定

2．2 病毒RT-PCR鉴定

2．3 基因核苷酸序列分析

2．4 氨基酸序列比对

2．5 遗传演化分析

3 讨论

参考文献

第四章 H3N2亚型犬流感病毒NP蛋白的表达与纯化

1 材料与方法

1．1 病毒株、血清、菌株及载体

1．2 主要试剂

1．3 引物设计

1．4 病毒RNA提取与反转录

1．5 重组表达质粒的构建与鉴定

1．6 NP蛋白的诱导表达与纯化

2 结果

2．1 NP基因的扩增

2．2 重组质粒的酶切鉴定

2．3 重组NP蛋白的SDS-PAGE分析

2．4 Western-blot分析结果

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢

附录