凤眼莲(Eichhonia crassipes)及根际微生物在治理富营养化水体中的脱氮特征及作用机制研究

摘要

水体富营养化日益严峻，已成为全球环境难题。氮(N)是水体生态系统中循环最活跃的元素之一，与水体富营养化关系密切。富营养化水体中氮的迁移、转化所涉及的物理、化学及生物等作用的复杂过程，一直是国际上研究的热点。生态修复治理水体富营养化是目前最具优势和应用前景的技术手段，其中植物生态修复的研究与应用更为广泛。本文针对模拟试验和大面积湖泊实践研究中漂浮植物凤眼莲(Eichhonia crassipes)修复富营养化水体过程中除植物吸收外还有相当部分的氮去向不明的现象，通过15N示踪技术并结合水体硝化、反硝化脱氮产物(N2O、N2)直接测定法，研究凤眼莲在修复富营养化水体过程中的脱氮特征;在此基础上，通过模拟试验以及滇池流域采样调查分析反硝化细菌丰度及群落多样性，研究凤眼莲修复富营养化水体过程中含氮气体排放、脱氮途径及相关机理。
　　直接测定反硝化脱氮气态产物的模拟实验结果表明，在设定的水体富营养化条件下（NH4+-N浓度6.0-7.2mg·L-1、NO3--N浓度0.81～5.14mg·L-1、TN（总氮）浓度为8.9-12.07mg·L-1），种植凤眼莲的处理向大气界面累积释放N2形式损失的N量占水体N损失量的69.8±18.5.1％-76.9±3.0％，而凤眼莲吸收的N仅占水体TN损失量的23.7±3.1％-28.7±4.8％。未种植凤眼莲的处理向大气界面累积释放N2形式损失的N量为占整个水体N损失量的49.0±9.4％-49.7±0.9％。在NH4+-N、NO3--N和TN浓度分别为9.35～9.52mg·L-1、2.00～2.35mg·L-1和11.83～12.62mg.L-1的富营养化水体中，种植凤眼莲处理释放N2O态氮量占整个水体N消减量的1.36％，为相应未种植凤眼莲处理的4.31倍。种植凤眼莲的富营养化水体向大气界面释放的N2和N2O量均显著(p＜0.05)高于相应处理下未种植凤眼莲的对照水体，说明凤眼莲在修复富营养化水体过程中不仅吸收水体氮素能力强，还可能对水体反硝化脱氮过程有促进作用。
　　通过向水体中加入N-15标记的15NH4+-N或15NO3--N，利用N-15示踪技术进一步验证了凤眼莲修复富营养化水体过程中反硝化脱氮释放气态产物（15N2和15N2O）是去除水体氮的一个重要途径。研究结果还表明种植凤眼莲的水体释放N2和N2O的N-15原子百分超远远高于未种植凤眼莲的富营养化水体，这直接证明了凤眼莲具有促进富营养化水体反硝化脱氮过程的能力。对种植和未种植凤眼莲的富营养化水体中15NH4+-N或15NO3--N的归趋途径进行详细分析，发现未种植凤眼莲的水体中很大一部分N被藻类吸收（27.13±4.87％15N-NO3-，42.08±7.22％15N-NH4+），这部分藻类存储的生物态N随着蓝藻的生长或死亡仍然滞留在水体当中。种植凤眼莲控制了水体中藻类的生长。凤眼莲直接吸收N去除了水体中相当一部分的N（62.01±6.93％15N-NO3-，76.76±6.21％15N-NH4+），说明凤眼莲对人工配置的成分明确的富营养化水体中氮的吸收效果显著高于自然条件下污染成分复杂且氮浓度较高的富营养化水体。同时，凤眼莲能够促进水体的反硝化脱氮过程，同位素示踪结合平衡质量法计算，在设定的水体富营养化条件下（NH4+-N浓度5.60±0.55mg·L-1和TN浓度9.06±0.18mg·L-1或NO3--N浓度5.35±0.48mg·L-1和TN浓度为7.63±0.45mg·L-1)，相当一部分15N通过硝化、反硝化过程转化为N2(25.00％15N-NO3-，20.85％15N-NH4+)和N2O(8.61±1.70％15N-NO3-，0.32±0.036％15N-NH4+)。结果进一步明确了凤眼莲主要通过直接吸收以及促进反硝化脱氮途径消减水体氮素。
　　在明确了凤眼莲能够促进富营养化水体反硝化脱氮过程的基础上，从微生物是反硝化脱氮过程主要驱动者的科学视点出发，本文重点研究了凤眼莲调节富营养化水体反硝化脱氮过程的微生物学机制。以反硝化作用中将无机态氮转化为气态氮的几个关键酶的编码基因（nirK、nirS、nosZ）为切入点，利用分子生物学手段，通过研究凤眼莲对富营养化水体修复系统中反硝化微生物群落结构多样性和丰度的调节作用，探索凤眼莲介导下nirK、nirS、nosZ反硝化功能基因变化与反硝化脱氮释放气态产物的耦合关系。模拟试验的研究结果表明凤眼莲根系上附着的nirK，nirS和nosZ型反硝化细菌的物种多样性要高于其生长的水体，说明凤眼莲庞大的根系表面积和根系分泌物可能为反硝化细菌的附着和生长提供了有利条件。凤眼莲修复系统的nirK，nirS和nosZ型反硝化细菌的丰度显著高于未种植凤眼莲的处理，进一步说明凤眼莲根系适合反硝化细菌形成优势菌群，富集丰富的反硝化细菌数量。凤眼莲根系对nirK，nirS和nosZ型反硝化细菌丰度和种群多样性的促进作用，以及凤眼莲修复富营养化水体过程中产生的气态氮损失（N2O和N2）与反硝化细菌丰度显著相关同时证明了反硝化作用的发生，也说明了凤眼莲通过调节反硝化细菌的物种多样性和丰度，促进了水体反硝化作用，显著增强了富营养化水体中氮元素的去除效果。
　　在模拟实验证明了凤眼莲通过调节反硝化细菌的物种多样性和丰度促进了水体反硝化过程的基础上，为了研究水体中环境因子与凤眼莲对反硝化细菌的共同调节作用，从而预测凤眼莲修复滇池流域水体过程中的脱氮特征及含氮气体排放规律，对滇池流域凤眼莲生态修复工程实施过程中水体及凤眼莲根系的nirK，nirS和nosZ型反硝化细菌进行了调查分析。结果表明反硝化细菌中的nirK，nirS和nosZ基因多样性在整个滇池流域的水体及根系表面都具有明显的空间分布变异，这种变化规律和水体中的环境因子具有密切的关系，但是环境因子对不同的样品的影响程度不同，表现出明显的空间特异性。根据统计分析的结果，环境参数能更好地解释大面积水域的反硝化细菌群落多样性变异。根系样品中nirK，nirS和nosZ型反硝化细菌在整个滇池流域中的空间分布变异不仅和水体中的环境因子密切相关，也受凤眼莲根系环境的影响较大。
　　凤眼莲对滇池流域中反硝化细菌的群落结构和生态功能影响均较大，在污染程度较严重的河流中中生长的凤眼莲会利用其自身对污染物质的吸收和富集作用而重新构建其特有的根际环境，有利于提高反硝化细菌多样性丰度，从而在污染程度严重的污水中进行脱氮修复。污水处理厂排出的NO3-浓度及人工驯化的反硝化细菌浓度均较高的再生水对河流的入湖河口及近河口的湖区反硝化细菌的群落多样性和细菌丰度影响显著，导致周边水域中反硝化群落多样性的减少和人工驯化的优势反硝化细菌数量的急剧上升。滇池流域根系样品中nirK基因拷贝数和nirS基因拷贝数的比值（K/S）变化规律说明在入湖河流中，nirK型反硝化细菌可能比nirS型反硝化细菌适应性更强。通过对nos/nir比值的分析，预测面积相对狭窄，流速较快的入湖河流对N2O的排放通量要低于面积广阔且水流缓慢的滇池湖区。而nos/nir在根系样品中的比值均显著高于同区域的水体样品中，说明种植在富营养化水体中的凤眼莲根系有可能提高反硝化产物中的N2/(N2+N2O)比，降低温室气体N2O的释放。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略语

第一章 文献综述

1．1 水体富营养化现状

1．1．1 水体富营养化成因及危害

1．1．2 滇池富营养化现状

1．1．3 水体富营养化控制措施

1．2 水体富营养化生态修复技术

1．2．1 人工湿地修复技术

1．2．2 利用漂浮植物或人工浮床修复技术

1．2．3 漂浮植物凤眼莲修复富营养化水体的机制研究

1．2．4 漂浮植物修复富营养化水体中硝化反硝化研究方法

1．2．5 水生生态系统修复过程硝化反硝化细菌研究

1．3 水体微生物研究方法

1．3．1 微生物研究技术

1．3．2 生态学多元排序分析

1．4 研究内容及意义

第二章 材料与方法

2．1 凤眼莲对富营养化水体脱氮过程的影响(15N示踪试验)

2．1．1 凤眼莲培育及N-15标记的富营养水体配置

2．1．2 实验设计

2．1．3 化学分析方法

2．1．4 总DNA的提取

2．1．5 反硝化细菌功能基因PCR扩增

2．1．6 DGGE电泳分析

2．1．7 qPCR分析

2．1．8 统计分析方法和计算公式

2．2 凤眼莲不同生长条件下对富营养化水体脱氮特征及含氮气体排放研究

2．2．1 凤眼莲培育及富营养水体配置

2．2．2 实验处理和实验设计

2．2．3 含氮气体测定方法

2．2．4 水样NH4+、NO3-、NO2-及TN的浓度测定

2．2．5 计算方法

2．2．6 统计分析方法和计算公式

2．3 滇池流域水体反硝化细菌群落多样性及丰度研究

2．3．1 样品采集

2．3．2 取样方法

2．3．3 环境参数测定

2．3．4 总DNA的提取

2．3．5 反硝化细菌功能基因PCR扩增

2．3．6 DGGE电泳分析

2．3．7 qPCR分析

2．3．8 统计分析方法和计算公式

2．4 滇池流域凤眼莲根系反硝化细菌群落多样性及丰度研究

2．4．1 样品采集

2．4．2 取样方法

2．4．3 环境参数测定

2．4．4 总DNA的提取

2．4．5 反硝化细菌功能基因PCR扩增

2．4．6 DGGE电泳分析

2．4．7 qPCR分析

2．4．8 统计分析方法和计算公式

第三章 凤眼莲对富营养化水体脱氮过程气体释放的影响

3．1 引言

3．2 结果

3．2．1 水体中NH4+-N、NO3--N、NO2--N的变化

3．2．2 种植或未种植凤眼莲水体-大气界面释放N2、N2O气体浓度变化规律

3．2．3 硝化、反硝化脱氮及植物吸收对消减水体氮的贡献

3．3 讨论

3．4 本章小结

第四章 凤眼莲修复富营养化水体过程中含15N气体释放及15N的归趋

4．1 引言

4．2 结果与分析

4．2．1 凤眼莲对富营养化水体15N2释放的影响

4．2．2 凤眼莲对富营养化水体15N2O释放的影响

4．2．3 凤眼莲对富营养化水体脱氮途径的影响

4．3 讨论

4．3．1 凤眼莲促进富营养化水体15N2的释放

4．3．2 凤眼莲促进富营养化水体15N2O的释放

4．3．3 凤眼莲对富营养化水体脱氮途径的影响

4．4 本章小结

第五章 凤眼莲根系对反硝化细菌多样性及丰度的影响

5．1 引言

5．2 结果与分析

5．2．1 根系及水体样品DNA提取结果

5．2．2 nirS，nirK和nosZ基因片段PCR结果

5．2．3 nirS，nirK和nosZ基因片段DGGE图谱分析

5．2．4 nirS，nirK和nosZ基因片段qPCR定量分析

5．3 讨论

5．3．1 凤眼莲对硝化细菌遗传多样性及丰度的影响

5．3．2 反硝化细菌与含氮气体排放的相关性

5．4 本章小结

第六章 滇池流域水体反硝化细菌遗传多样性及丰度分析

6．1 引言

6．2 结果

6．2．1 环境理化指标参数

6．2．2 滇池流域水体样品DNA提取结果

6．2．3 水体样品中nirS，nirK和nosZ基因片段PCR结果

6．2．4 水体样品中nirS，nirK和nosZ基因片段DGGE图谱分析

6．2．5 水体样品中nirS，nirK和nosZ基因片段qPCR定量分析

6．3 讨论

6．3．1 环境理化指标分析

6．3．2 滇池及入湖河流反硝化细菌遗传多样性变化

6．3．3 滇池及入湖河流反硝化细菌丰度变化

6．4 本章小结

第七章 滇池流域种植的凤眼莲根系反硝化细菌遗传多样性及丰度分析

7．1 引言

7．2 结果

7．2．1 环境参数

7．2．2 滇池流域审根系样品DNA提取结果

7．2．3 凤眼莲根系样品中nirS，nirK和nosZ基因片段PCR结果

7．2．4 凤眼莲根系样品中nirS，nirK和nosZ基因片段DGGE图谱分析

7．2．5 凤眼莲根系样品中nirS，nirK和nosZ基因片段qPCR定量分析

7．3 讨论

7．3．1 滇池流域凤眼莲根系反硝化细菌遗传多样性变化

7．3．2 滇池流域凤眼莲根系反硝化细菌丰度变化

7．4 本章小结

第八章 全文总结

本文创新之处

展望

参考文献

攻读博士期间已(拟)发表的论文目录

致谢