HSP32基因在热应激小鼠睾丸组织中的表达及其作用机制的研究

摘要

本文研究了不同程度热应激对小鼠睾丸结构，氧化指标及血清睾酮的影响，探讨了不同热应激环境下小鼠睾丸细胞凋亡及HSP32基因的表达情况。并通过体外支持细胞培养，进一步研究了热应激条件下支持细胞凋亡及HSP32基因的表达情况。同时通过siRNA技术建立了阻抑HSP32基因表达的支持细胞模型，探讨阻抑和激活支持细胞中HSP32表达对细胞凋亡的影响，旨在揭示HSP32对热应激状态下的细胞保护作用，为进一步研究应激状态下曲细精管的微环境提供一定的参考依据。
　　1、慢性及急性热应激对小鼠睾丸结构，氧化能力及血清睾酮的影响
　　本试验的目的是研究长期慢性和短期急性热暴露对小鼠睾丸组织氧化平衡、组织结构及血清睾酮水平的影响。慢性热处理:选取48只3周龄小鼠随机分成两组，热处理组每天置于温度为39℃湿度为60％的人工气候箱1.5h，持续6周。分别在热处理1、3、6周取样。急性热处理，选取48只9周小鼠随机分成两组，热处理组置于43℃湿度为60％的人工气候箱30min后，于恢复后3h、6h和12h取样。首先测定睾丸组织超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽过氧化酶(GPx)活性及反应脂质过氧化水平的丙二醛(MDA)含量。同时观察睾丸组织形态学变化和测定血清中睾酮含量。结果表明急性及慢性热处理都可以引起睾丸组织形态学的改变，但这种改变在慢性热处理后期可以通过机体的适应性调节来恢复。慢性热处理1周、3周后睾丸组织的氧化平衡被打破，SOD和GPx氧化酶水平降低，MDA水平升高。急性热处理组中，氧化酶活性与对照组无显著差值，但MDA含量显著升高(P＜0.01)。慢性的热处理引起睾酮含量下降，但差异不显著;急性的热处理引起睾酮含量显著下降(P＜0.01)。以上研究结果表明，长期的慢性热处理会引起机体对抗热应激有害影响的适应性改变。急性热应激对小鼠产生影响的严重程度大于慢性热应激。
　　2、热应激对小鼠睾丸细胞周期、凋亡及HSP32和Caspase-3表达的影响
　　热应激环境会引起动物机体一系列热休克蛋白的表达。其中HSP32作为一种热休克蛋白在许多器官中发挥细胞保护作用。本试验目的是研究长期慢性和短期急性热暴露对小鼠睾丸细胞周期、凋亡及HSP32基因表达的影响，同时探讨凋亡相关基因Caspase-3的表达及活性，阐明应激状态下HSP32在睾丸组织中的表达规律。结果表明急性及慢性热处理都可以引起睾丸组织HSP32蛋白的过表达，且热处理可以诱导睾丸细胞发生凋亡和细胞周期的改变。其中慢性热处理后期，睾丸组织的细胞周期和细胞凋亡情况与对照组相比差异不显著，但HSP32一直处于高表达状态。以上研究结果提示，在热应激睾丸组织中HSP32可能作为一种细胞保护因子通过抑制Caspase-3的表达，保护睾丸细胞免受损伤。
　　3、热应激对小鼠睾丸支持细胞凋亡及HSP32和Caspase-3表达的影响
　　睾丸组织中睾丸支持细胞是主要表达HSP32蛋白的细胞，且其是生精上皮中唯一与生殖细胞相接触的细胞。因支持细胞在精子发生微环境调节中发挥重要作用，所以支持细胞发生损伤都会对精子发生微环境产生影响。本试验研究体外培养的支持细胞在慢性及急性的热刺激下HSP2的表达、细胞凋亡及凋亡基因Caspase-3的表达情况。结果表明，慢性的热处理不能诱导细胞凋亡的发生，但是可诱导HSP32的过表达。而急性热处理可诱导细胞发生凋亡及HSP32和Caspase-3的高表达。结果提示，在热损伤相关的细胞凋亡中由支持细胞表达的HSP32蛋白，发挥一定的细胞保护作用。
　　4、阻抑和激活HSP32基因对热处理后小鼠支持细胞凋亡及凋亡通路的影响
　　为了进一步确认HSP32的细胞保护作用，本实验选取了化学合成针对HSP32的siRNA和HSP32的诱导剂血晶素体外处理支持细胞，观察单一急性热处理情况下阻抑和激活HSP32基因，其对细胞凋亡的影响，同时通过测定细胞内cGMP水平、Caspase-3的活性及细胞培养上清中一氧化碳(CO)含量。结果表明，在正常培养的支持细胞中，用siRNA特异性抑制HSP32的表达，可以引起细胞凋亡率增加;在热处理的细胞中，siRNA特异性抑制HSP32的表达可以进一步增强热处理引起的细胞凋亡;而HSP32特异性激活剂hemin可以引起热处理后细胞凋亡率的降低;HSP32来源的CO增加了支持细胞中cGMP水平。以上的结果提示，HSP32是支持细胞的一种应激性蛋白，其发挥细胞保护的作用，其中其代谢产物CO通过激活sGC信号参与热应激状态下支持细胞的抗凋亡过程。
　　本文研究表明HSP32这种只在支持细胞表达的蛋白是支持细胞的一种应激性蛋白，其参与热应激状态下支持细胞的抗凋亡过程，表明该蛋白在调节曲细精管微环境中发挥重要作用。试验首次在支持细胞中采用激活剂和siRNA技术干涉激活和抑制HSP32表达，以探讨HSP32的生物学功能。

目录

论文说明

声明

摘要

引言

第一部分 文献综述

2．HSP32基因表达的诱导与调节

3．HSP32及反应产物的保护作用

4．HSP32在睾丸中的表达及作用

5．总结

参考文献

第二章 热对哺乳动物睾丸的影响

1．热处理的方法

2．热对雄性动物的影响

3．热引起的细胞损伤机制

4．热和其他影响因子对睾丸的交互作用

5．遗传可塑性对调节热应激的影响

6．总结

参考文献

第二篇 实验研究

第三章 慢性及急性热应激对小鼠睾丸结构，氧化能力及血清睾酮的影响

1 材料与方法

2．结果和分析

3 讨论

4．结论

参考文献

第四章 热应激对小鼠睾丸细胞周期、凋亡及HSP32、Caspase-3表达的影响

1 材料与方法

2．结果和分析

3 讨论

4．结论

参考文献

第五章 热应激对小鼠睾丸支持细胞凋亡及HSP32表达的影响

1 材料与方法

2．结果和分析

3 讨论

参考文献

第六章 阻抑和激活HSP32基因对热处理后小鼠支持细胞凋亡及凋亡通路的影响

1 材料与方法

2．结果和分析

3 讨论

参考文献

全文结论

附录

缩略词(Abbreviation)

攻读博士学位期间发表的论文

致谢