小菜蛾氨肽酶N2和ABC转运蛋白C2在Cry1Ac抗性中的作用

摘要

小菜蛾Plutellaxylostella(L.)属鳞翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，是十字花科蔬菜最主要的害虫之一。小菜蛾生长周期短，繁殖率高，适应性强，世代重叠严重，可以长距离迁飞，故其田间防治的难度系数较大。目前，小菜蛾已对包括Bt制剂在内的至少84种药剂产生了抗性，据估计全球每年小菜蛾为害造成的损失在40-50亿美元，抗性治理形势不容乐观。
　　苏云金芽孢杆菌在产生孢子的过程中有伴孢晶体的形成，这些伴孢晶体具有一定的杀虫作用，称之为杀虫晶体蛋白，即Bt毒素。作为首个对微生物农药Bt制剂产生抗药性的物种，众多昆虫学和毒理学研究人员对小菜蛾的抗药性问题给予高度重视并进行了大量的抗性调查和研究工作。本文系统研究了PxAPN2基因在小菜蛾抗性和敏感品系四龄幼虫中肠内的mRNA表达量，以及其表达量变化对小菜蛾Cry1Ac抗性水平的影响;克隆了抗性和敏感品系中ABC转运蛋白C2基因（PxABCC2），研究了其在四龄幼虫中肠内的mRNA表达量，并利用分子标记技术确定了PxABCC2基因与Bt抗性的不完全连锁关系。
　　1.小菜蛾PxAPN2基因mRNA表达水平下降与Cry1Ac抗性的相关性
　　利用定量PCR技术研究了小菜蛾的PxAPN2基因在Cry1AC抗性品系SZBT、敏感品系ROTH以及抗性对照品系SZ中的表达量，结果发现:相对于敏感品系ROTH，对照品系SZ的PxAPN2基因表达量为其0.95倍，而抗性品系SZBT中该基因表达量则为其0.51倍。利用体外合成的dsRNA，对敏感品系的PxAPN2基因进行干扰，结果表明:喂食dsRNA的小菜蛾三龄幼虫的PxAPN2基因的表达量分别下调30％、57％，对Cry1Ac分别产生4.3、6.9倍的抗性，随着干扰效率的升高，小菜蛾对毒素的抗性也相应提高。
　　2.RNAi敲减各品系PxAPN2基因的表达对Cry1Ac敏感性的影响
　　将含有PxAPN2基因dsRNA的菌液以及含有绿色荧光蛋白(GFP)dsRNA的菌液喂食到三个品系小菜蛾3龄幼虫体内，以研究PxAPN2基因沉默后对Cry1Ac毒力的影响。对敏感品系ROTH的干扰，相对于只喂食绿色荧光蛋白(GFP)为靶基因的dsGFP的小菜蛾敏感品系(CK)，喂食表达dsAPN2的细菌液的小菜蛾三龄幼虫的PxAPN2基因的表达量分别下调25％、35％，干扰后3龄小菜蛾幼虫对Cry1Ac分别产生3.4、3.8倍的抗性;对对照品系SZ的干扰，PxAPN2基因的表达量分别下调31％、32％，对Cry1Ac分别产生3.4、2.6倍的抗性;对抗性品系SZBT的干扰，PxAPN2基因的表达量分别下调20％、23％，对Cry1Ac分别产生2.1、2.2倍的抗性。上述结果表明，对小菜蛾PxAPN2不同表达水平的3个品系分别进行RNAi敲减，均可导致Cry1Ac抗性水平增加。该研究结果进一步证实PxAPN2的表达量降低与小菜蛾对Cry1Ac的抗性相关。
　　3.小菜蛾PxABCC2基因的克隆及在各品系间的表达量比较
　　克隆了小菜蛾PxABCC2基因的全长cDNA，该基因编码1332个氨基酸。通过比对抗性和敏感品系个体的PxABCC2基因序列，没有发现与抗性相关的突变位点。采用比较CT值的相对定量法（2-ΔΔCT法），研究了该基因在小菜蛾不同品系（抗性品系、敏感品系和对照品系）中的表达量。结果表明:相对于敏感品系ROTH，对照品系PxABCC2基因的表达量为其1.4-1.5倍，而抗性品系SZBT的表达量则为其3.2-3.4倍。
　　4.PxABCC2基因与Cry1Ac抗性的遗传连锁分析
　　分别以Bt毒素Cry1Ac抗性品系SZBT和敏感品系ROTH为实验材料，对其PxABCC2的基因组DNA进行克隆，获得可区分抗性和敏感品系的一个分子标记。通过遗传连锁分析，发现PxABCC2基因与Cry1Ac抗性不完全连锁。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 Bt毒素Cry1A的作用机理

2 Bt毒素受体—氨肽酶N

2．1 氨肽酶的结构特征

2．2 氨肽酶的分类

2．3 APN在昆虫对Bt抗性上的研究

3 Bt毒素受体—ABC转运蛋白

3．1 ABC转运蛋白的作用和结构

3．2 ABCC2在昆虫对Bt抗性上的研究

4 RNAi在Bt抗性机理研究中的应用

4．1 RNA干扰在鳞翅目昆虫中的应用

4．2 RNA干扰在Bt抗性机理研究中的应用

5 小菜蛾Bt抗性的研究进展

5．1 小菜蛾的发生及危害

5．2 小菜蛾Bt抗性的研究进展

6 本研究的目的和意义

第二章 小菜蛾PxAPN2基因mRNA表达水平下降与Cry1Ac抗性的相关性

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂和仪器设备

1．3 小菜蛾cDNA模板制备

1．4 dsRNA的制备

1．5 荧光实时定量PCR

1．6 饲喂dsRNA幼虫的生测

2 结果与分析

2．1 dsRNA的制备

2．2 PCR产物融解曲线及荧光定量PCR扩增效率一致性分析

2．3 品系间PxAPN2基因相对表达量比较

2．4 PxAPN2基因沉默对Cry1Ac毒力的影响

3 讨论

第三章 RNAi敲减各品系PxAPN2基因的表达对Cry1Ac敏感性的影响

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂和仪器设备

1．3 双链RNA表达载体构建

1．4 大肠杆菌HT115感受态细胞的制备

1．5 dsRNA在大肠杆菌中的表达

1．6 喂食表达dsRNA细菌液的试验方法

1．7 饲喂dsRNA幼虫的生测

1．8 目标基因表达量分析

2 结果与分析

2．1 dsRNA表达载体构建

2．2 dsRNA在大肠杆菌中的表达

2．3 PxAPN2基因沉默对Cry1Ac毒力的影响

3 讨论

第四章 小菜蛾PxABCC2基因的克隆及在各品系间的表达量比较

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂和仪器设备

1．3 小菜蛾cDNA模板制备

1．4 PCR反应

1．5 PCR产物的纯化回收

1．6 连接反应

1．7 转化反应

1．8 扩大培养

1．9 目标片段检测

1．10 测序与分析

1．11 荧光实时定量PCR

2 结果与分析

2．1 敏感及抗性品系ABCC2基因的克隆

2．2 PCR产物融解曲线和扩增效率一致性分析

2．3 品系间PxABCC2基因相对表达量比较

3 讨论

第五章 PxABCC2基因与Cry1Ac抗性的遗传连锁分析

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂和仪器设备

1．3 基因组DNA的制备

1．4 PxABCC2基因组全长克隆

1．5 抗性遗传连锁分析

2 结果与分析

2．1 敏感及抗性品系ABCC2基因组的克隆

2．2 遗传连锁

3 讨论

全文总结

参考文献

致谢