猪流行性腹泻病毒FQ-PCR检测方法的建立及四个毒株全基因测序和进化分析

摘要

猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）是猪流行性腹泻病（porcineepidemicdiarrhea,PED）的病原，属于冠状病毒科，为有囊膜，单股正链RNA病毒。该病是一种急性、高度接触性的传染病，以严重肠炎、呕吐和水样腹泻为特征，对我国养猪产业造成严重的经济损失。2010-2012年，PED在免疫猪场的再次爆发说明我国流行毒株可能发生了变异，导致疫苗免疫效果下降，因此对我国流行毒株进行系统进化分析，比较疫苗株与野毒株之间的差异，有利于更具保护力的新型疫苗的开发。
　　首先，建立了PEDV的实时荧光定量PCR检测方法并应用于PEDV细胞培养物中病毒拷贝数的检测。根据PEDVM基因保守序列设计合成一对引物和探针，通过反应条件和反应体系的优化，成功建立了TaqMan实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法，该方法具有特异、灵敏、快速等优点，在101-109拷贝/ul之间具有良好的线性关系，相关系数达到0.99以上，扩增效率在90％-110％之间。
　　其次，本研究根据GenBank上登录的PEDV参考株CV777(AF353511)的基因组序列设计合成22对引物，扩增3株野毒株和1株细胞适应株进行了全基因组序列，之后与GenBank上登录的PEDV毒株进行比对分析，构建系统进化树。结果表明，多数我国流行毒株位于同一亚群中且与疫苗株CV777的遗传进化距离较远。

目录

声明

摘要

引言

1 猪流行性腹泻的历史背景

2 病原学

2．1 病毒的形态

2．2 分类地位

2．3 理化特性

2．4 细胞培养特性

2．5 病毒基因组及其编码蛋白

3 流行病学

4 诊断方法

4．1 RT-PCR诊断方法

4．2 免疫电镜

4．3 免疫荧光

4．4 酶联免疫吸附试验

4．5 实时荧光定量PCR

5 PED的治疗

6 PED的预防

6．1 PEDV灭活苗

6．2 PEDV弱毒苗

参考文献

第一章 猪流行性腹泻病毒FQ-PCR检测方法的建立

1 材料与方法

1．1 菌株、毒株及病料

1．2 主要试剂和仪器

1．3 引物和探针的设计及合成

1．4 重组质粒标准品的制备

1．5 FQ-PCR检测方法的建立

2 结果与分析

2．1 质粒标准品的制备

2．2 FQ-PCR反应条件的优化

2．3 FQ-PCR标准曲线的建立

2．4 FQ-PCR的敏感性分析

2．5 FQ-PCR的重复性分析

2．6 FQ-PCR的特异性分析

2．7 细胞培养物中PEDV的定量检测

3 讨论

参考文献

第二章 PEDV全基因测序和进化分析

1 材料与方法

1．1 细胞和毒株

1．2 样品

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器设备

1．5 引物

1．6 RNA的提取

1．7 反转录

1．8 PCR

1．9 PCR产物鉴定及纯化回收

1．10 PCR产物连接与转化

1．11 重组质粒提取、鉴定及序列测定

1．12 全基因组序列确定、分析和比较

1．13 参考序列

2 结果

2．1 JS2008、AH2012、JS-HZ2012和SX2012毒株的基因组结构及分析

2．2 S基因序列分析

2．3 ORF3进化分析

2．4 E基因序列分析

2．5 M基因序列分析

2．6 N基因进化分析

3 讨论

参考文献

全文结论

致谢