猪嗜血支原体的猪体感染试验和小鼠感染试验研究

摘要

猪嗜血支原体病即猪附红细胞体病（PorcineEperythrozoonosis，PE）是由猪嗜血支原体（Mycoplasma.suis,M.suis）寄生于红细胞导致的一种热性、急性、溶血性黄疸贫血人兽共患传染病。慢性轻度感染的临床表现多样，从无症状感染到一系列临床症状感染，新生仔猪表现为贫血、温和性黄疸，育肥猪生长迟缓，青年母猪繁殖能力下降。由于急性贫血和慢性持续性感染能够提高呼吸和消化系统疾病的易感性，该病对养猪业造成了严重的经济损失。为了深入研究猪嗜血支原体致病机制，本研究建立了猪嗜血支原体实时荧光定量PCR，阐明了猪嗜血支原体血液中含量和血液动力学之间的相关性。而且，通过感染猪体实验记录了猪嗜血支原体病的临床症状、血液学和生物化学指标、菌血症、抗体水平、细胞因子变化以及组织病理学等各个方面变化，同时建立了小鼠6种细胞因子的实时荧光定量PCR方法和进行了小鼠的初步感染试验。具体研究内容和结果分为以下3个部分:
　　1.猪嗜血支原体荧光定量PCR检测方法的建立
　　根据GenBank发表的猪嗜血支原体16SrRNA基因序列设计合成荧光定量PCR引物，用构建的含16SrRNA基因的重组质粒为阳性模板，通过优化反应条件，建立猪嗜血支原体荧光定量PCR检测方法。用建立的SYBRGreen-basedreal-timePCR方法对猪嗜血支原体进行定量。根据熔解曲线、琼脂糖凝胶电泳以及扩增片段测序分析确证方法的特异性;用构建的猪嗜血支原体16SrRNA基因的阳性质粒进行梯度稀释建立标准曲线，并分析其敏感性;通过组内和组间试验检测建立的检测方法的重复性。结果证明此方法有很好的特异性、敏感性和重复性，检测的下限是15个拷贝的猪嗜血支原体。本方法能够很好的用于对猪嗜血支原体准确定量。
　　2.猪嗜血支原体病感染模型的建立
　　猪嗜血支原体病是一种热性、急性、溶血性黄疸贫血人兽共患传染病。为研究猪嗜血支原体致病机制，本研究将10头保育猪（5-6周龄）随机分为3组，分别为攻毒猪嗜血支原体组（3头，A组）、切脾后攻毒猪嗜血支原体组（4头，B组）和对照组（3头，C组）。感染后隔离饲养，每天测量体温以及观察临床症状，每周测量两次体重。在7、14、21、28天时分别采集各组血液样本检测血液学和生物化学指标、菌血症、抗体水平以及细胞因子，28天时，对三组猪进行病理剖检和组织学检查。感染后一周内A组和B组都出现临床症状，C组没有明显临床症状。在感染后7天时，A组和B组均检测到水平相当的菌体，达到1.0×105拷贝/mL血液。14天时，B组达到1.0×108拷贝/mL血液，并在这一水平小幅波动直至实验结束;而和感染后一周相比，A组菌血症在14天时略有上升，到21天时急剧上升到和B组达到同一水平并直至实验结束。血液学和生物化学检测指标显示，7天时，B组的红细胞计数显著高于C组，而到21天时，B的红细胞计数、血细胞比容、血铁含量、血红蛋白浓度均低于C组;B组的红细胞计数和血红蛋白含量显著低于C组。猪嗜血支原体量和白细胞计数、血细胞比容、红细胞计数和铁等指标显著相关。21天时，A组中只有1头猪产生猪嗜血支原体抗体，28天时此猪抗体阻断率上升;其余的猪体内并未检测到猪嗜血支原体抗体。三组猪血清中均没有检测到细胞因子IL-4和IFN-γ。本研究复制出了猪嗜血支原体病，探讨了该病的发生发展过程，为该病的致病机制、预防、诊断等方面的研究奠定基础。
　　3.小鼠细胞因子荧光定量PCR检测方法的建立
　　本研究从小鼠脾脏分离淋巴细胞中提取细胞因子mRNA，反转录成cDNA，利用实时荧光定量PCR方法监测IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和IFN-β的mRNA表达水平。根据熔解曲线、琼脂糖凝胶电泳以及扩增片段测序分析各细胞因子的特异性;分别对构建的含各细胞因子基因部分序列的阳性质粒进行梯度稀释建立标准曲线，并分析其敏感性;通过组内和组间试验检测建立的检测方法的重复性。建立的各个细胞因子实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和IFN-β检测的敏感性分别可达到50拷贝、50拷贝、20拷贝、68拷贝、50拷贝和13拷贝。应用分离的猪嗜血支原体初步进行了小鼠感染试验，证明在常规条件下小鼠不能被猪嗜血支原体感染。

目录

声明

摘要

第一章 猪嗜血支原体病研究进展

1 猪嗜血支原体病研究概况

2 猪嗜血支原体的病原学

2．1 形态

2．2 分类

2．3 分子病原学

3 猪嗜血支原体病流行病学

3．1 流行概况

3．2 传播途径

3．3 感染宿主

4 猪嗜血支原体病的临床症状及病理变化

5 猪嗜血支原体病的血液学研究

6 猪嗜血支原体病的致病机理

7 猪嗜血支原体病的诊断

7．1 猪嗜血支原体病的临床诊断

7．2 猪嗜血支原体病的实验室诊断

8 猪嗜血支原体的防治

9 猪嗜血支原体病动物模型研究

参考文献

第二章 猪嗜血支原体荧光定量PCR检测方法的建立

1 材料和方法

1．1 菌种

1．2 试剂和菌株

1．3 引物

1．4 提取猪嗜血支原体DNA

1．5 荧光定量PCR扩增

1．6 目的片段的回收和克隆

1．7 重组质粒的提取

1．8 重组质粒的酶切鉴定及测序分析

1．9 荧光定量PCR条件优化

1．10 熔解曲线分析

1．11 荧光定量PCR的敏感性和标准曲线的建立

1．12 实时荧光定量PCR重复性

1．13 数据分析

2 结果

2．1 构建标准阳性质粒

2．2 实时荧光定量PCR体系的优化

2．3 实时荧光定量PCR的特异性

2．4 实时荧光定量PCR的敏感性和标准曲线的建立

2．5 实时荧光定量PCR的重复性试验

3 讨论

参考文献

第三章 猪嗜血支原体猪体感染试验

1 材料和方法

1．1 试剂、菌株和实验动物

1．2 动物试验及分组

1．3 菌血症

1．4 血液学和生物化学指标变化

1．5 抗体和细胞因子

1．6 病理剖检和组织病理学检查

1．7 数据分析

2 结果

2．1 临床表现

2．2 体温

2．3 体重

2．4 菌血症检测

2．5 血液学和生物化学指标检测

2．6 猪嗜血支原体血液中含量和血液动力学参数的相关性

2．7 抗体和细胞因子检测结果

2．8 组织病理学变化

3 讨论

参考文献

第四章 小鼠细胞因子荧光定量PCR检测方法的建立

1 材料和方法

1．1 试剂和菌株以及实验动物

1．2 细胞因子引物的设计

1．3 RNA的提取和cDNA的合成

1．4 脾脏淋巴细胞的分离

1．5 实时荧光定量PCR

1．6 目的片段的扩增

1．7 重组质粒提取

1．8 酶切鉴定重组质粒及测序分析

1．9 熔解曲线分析

1．10 实时荧光定量PCR敏感性和标准曲线的建立

1．11 实时荧光定量PCR重复性

1．12 小鼠攻毒试验

1．13 数据分析

2 结果

2．1 构建标准阳性质粒

2．2 特异性

2．3 敏感性和标准曲线

2．4 实时荧光定量PCR的重复性试验

2．5 小鼠感染试验

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢