利用环介导等温扩增和Padlock探针技术检测瓜蔓枯病菌

摘要

植物病原茵的检测与鉴定技术的研究是我国各口岸检验工作的重点，对阻止外来有害生物的入侵从而保护我国农林业经济安全生产活动与生态安全有着重要的意义。目前为止传统的检测技术及现有的分子检测技术如传统PCR技术已无法满足上述要求，因此寻找其他更加稳定和特异的的检测靶标，并建立新的检测技术体系，变得越来越重要。
　　本研究通过分别利用环介导等温扩增(LAMP)技术和Padlock探针（同时结合了斑点杂交）技术这两种分子检测手段检测了瓜蔓枯病的病原真菌(Didymellabryoniae)并建立了其高效的检测体系。本研究的LAMP引物和Padlock探针的靶标位点选择的是看家基因之一的RNA聚合酶Ⅱ(RPB2)基因，并对这些引物和探针的特异性和灵敏度进行了实验验证。实验结果表明，实验中所使用的特异性引物和探针均可达到特异性检测特定病原茵的目的，并且其检测的灵敏度达到反应体系中DNA最低浓度阀值:200fg，较普通的PCR检测手段高出100倍，完全满足了检验工作的需求。同时，通过本实验室从全国各地收集的西瓜和甜瓜藤蔓样品的实际检测应用，其实验结果表明这两种检测手段都能很好的从33份样品中检测出17份。
　　本研究使用的环介导等温扩增技术检测周期短只需1h，灵敏度高，并且在反应过程中不涉及模板的变性与退火，所以不需要热循环仪，只需恒温水浴锅即可完成实验，加之反应结果肉眼可见。同时，Padlock探针技术也具有耗时短，灵敏度高以及易操作的特点，再结合斑点杂交技术将实验结果通过显色反映变得可视化，且保证了结果的特异性。都说明了这两种快速的分子检测技术高效、可靠、便捷，为今后的口岸检验工作提供了新的技术。

目录

声明

摘要

第一部分 文献综述

第一章 瓜蔓枯病简介

1 瓜蔓枯病简介

2 瓜蔓枯病原菌及病害特征

第二章 植物病原菌检测技术研究进展

1 病原菌检测背景及意义

2 病原菌分子检测技术研究进展

3 检测靶标的研究进展

4 环介导等温扩增技术简介

5 Padlock探针及斑点杂交技术简介

6 植物病原菌检测技术要求

第二部分 研究内容

第一章 环介导等温扩增技术检测瓜蔓枯病菌体系的建立

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与结论

第二章 Padlock探针技术检测瓜蔓枯病菌体系的建立

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的论文及申请的专利

致谢