江苏省蔬菜根结线虫的分布调查、种类鉴定及定量检测技术研究

摘要

根结线虫(Root-knotnematode，RKN)是一类世界性分布的威胁农业生产的植物根系专性内寄生线虫。近年来，随着我国保护地蔬菜面积的迅速发展，复种指数的增加，根结线虫病呈逐年加重趋势，严重影响了作物的产量与品质。土壤中根结线虫的群体密度与作物的受害程度关系密切，因此，准确、可靠和快速地鉴定和计数土壤中的根结线虫，对该病害的有效防治至关重要。本研究对江苏省9个地区蔬菜根结线虫的分布、发生种类以及群体密度进行了调查，分别建立了根结属线虫和南方根结线虫的实时荧光PCR定量检测方法，并利用此方法对田间土壤中的根结线虫进行了定量检测。主要结果如下:
　　2011年对江苏省9个地区25个乡镇蔬菜根结线虫的分布、发生种类以及群体密度进行了调查。结果表明，根结线虫平均发生率为73.6％，土壤中的线虫群体密度最高达到2920条/200mL土样，宿迁、淮安等地区根结线虫发生率较高，达100％，而盐城地区根结线虫发生率相对较低，为57.1％。SCAR标记分子鉴定揭示为害江苏省蔬菜的根结线虫种类有南方根结线虫（Meloidogyneincognita）、花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇根结线虫(M.javanica)和北方根结线虫(M.hapla)4类，其中南方根结线虫为优势种群。田间根结线虫种群大多数为单一种群，18％的样品为南方根结线虫与花生根结线虫或南方根结线虫与爪哇根结线虫2个种组成的混合种群。
　　为了快速检测和定量土壤中根结属线虫的群体密度，根据根结属线虫的18SrDNA保守序列，设计了一对根结线虫属特异性引物，通过直接提取土壤DNA，建立了土壤中根结属线虫的SYBRGreenIreal-timePCR检测方法。结果表明，该方法能够从土壤DNA中特异检测出根结属线虫，建立的标准曲线循环阈值与根结线虫数量的对数值之间具有良好的线性关系，相关系数为0.9836，扩增效率为80％，检测灵敏度为1条2龄幼虫，比普通PCR检测高10倍;对10个田间土壤样品进行检测显示，real-timePCR检测与显微镜计数检测根结线虫的数量呈显著的正相关性。
　　为了准确测定土壤中南方根结线虫的群体密度，根据SCAR标记设计了南方根结线虫特异性引物和TaqMan探针，分别建立了卵和2龄幼虫的real-timePCR定量检测体系，并将该体系与显微镜计数法进行了比较。结果表明，引物及探针对南方根结线虫具有高度特异性，建立的标准曲线循环阈值与卵和2龄幼虫数量的对数值之间具有良好的线性关系，相关系数分别为0.9771和0.9853，扩增效率均为90％，检测灵敏度为0.1个卵及0.001条2龄幼虫;对10个田间土壤样本的检测显示，real-timePCR定量检测与显微镜计数法测定的南方根结线虫卵和2龄幼虫数量呈显著的正相关性，且两种方法对2龄幼虫的测定结果无显著差异。
　　本研究建立的根结属线虫和南方根结线虫定量检测体系，能够快速、灵敏、特异性地测定土壤中根结属线虫和南方根结线的种群密度，可为根结线虫病害的预测预报及综合防控策略的制定提供技术支持。

目录

声明

摘要

上篇 文献综述

第一章 根结线虫的分布、危害及防治

1 根结线虫的发生与分布

2 根结线虫的危害

3 根结线虫的生物学特性

4 根结线虫病的防治方法

第二章 根结线虫的种类鉴定和检测方法

1 根结线虫的传统鉴定和检测方法

2 根结线虫的分子生物学鉴定和检测方法

下篇 研究内容

第一章 江苏省蔬菜根结线虫的分布调查及种类鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二章 根结属线虫的实时荧光PCR检测和定量

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 土壤中南方根结线虫的实时荧光PCR检测和定量

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

全文结论

参考文献

致谢