将军菊苣DREB家族基因的克隆、功能研究及其遗传转化体系的建立

摘要

干旱、高温、低温和高盐是严重影响作物生长发育及产量的环境胁迫因子。逆境响应转录因子通过顺式元件及其它相关蛋白之间的相互作用，可激活或抑制下游一系列抗逆功能基因的转录，从而提高植物的综合抗逆性，这在抗逆转基因育种中具有重要研究价值。植物中AP2家族的DREB类转录因子是近年来抗逆分子育种研究的热点，该类基因对提高植物的综合抗逆性具有重要科学意义和应用价值。
　　菊苣是我国重要的药食两用植物，是菊糖的主要来源。近几年已逐步取得了一些可喜进展，但对其基因研究进展仍然比较缓慢。利用现代基因工程技术进行菊苣的品种改良是当前菊苣育种的一个新方向，它可以打破生殖隔离，使得不同物种间遗传交流成为可能，为拓宽植物可利用基因库创造条件，弥补了常规杂交育种的不足，加速了作物遗传育种的发展。
　　本研究以将军菊苣为为材料，从菊苣中分离克隆了三条DREB类转录基因，并对其进行功能分析，同时建立农杆菌介导的将军菊苣遗传转化体系，为利用基因工程的方法改良菊苣的抗逆性提供基础。主要结果如下:
　　1.利用其他物种已经验证过功能的DREB类转录因子CDS序列，以及菊苣现有的EST数据库，通过电子克隆、RACE等技术手段克隆获得三条DREB类基因。序列分析表明这三个基因具有DREB转录因子所特有的功能结构域。序列比对表明三个基因和其他已知的DREB基因除了在保守的AP2/EREBP结构域处具有很高的同源性外，在其它区域的序列同源性不高。对将军菊苣材料进行各种胁迫处理(干旱、高盐、低温和ABA)，运用荧光定量PCR技术对DREB转录因子进行基因表达特性分析。结果表明，这三个CiDREB基因在菊苣植株对干旱、高盐、高温、低温和ABA的应答反应中起重要作用。CiDREB2不受干旱胁迫，主要对高温胁迫产生响应，ABA、低温、高盐也能诱导其表达量上升;CiDREB5受高温、低温和干旱诱导，而不受高盐的诱导，且参与不依赖ABA的调控途径;CiDREB6主要受高温和干旱强烈诱导，不受低温和高盐诱导，并且该基因在叶中的表达量比根中，且受高盐和干旱强烈诱导。
　　2.利用酵母单杂交的方法，将CiDREB2、CiDREB5、CiDREB6基因cDNA的编码区插入到酵母表达载体pGART7-AD中，将其分别转化到含有不同DRE元件报告质粒的酵母菌株中，观测转化的重组酵母菌株在SD/-Leu/-Trp/-His+40mM3-AT选择培养基上的生长情况。试验结果表明，CiDREB2、CiDREB5、CiDREB6都具有特异结合DRE元件的活性，并且DRE核心序列两端序列对其识别特异性有影响。把目的基因插入到35S启动子和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因之间，构建CiDREB转录因子的亚细胞定位重组载体。通过基因枪法转化洋葱表皮细胞，暗培养12h后共聚焦显微镜下观察，验证CiDREB是否具有核定位功能。研究结果表明，CiDREB2、CiDREB5、CiDREB6蛋白都可以在细胞核内产生EGFP的绿色荧光，说明这三个基因属于转录因子类基因，能够入核行使功能。
　　3.以将军菊苣子叶为材料，通过植物组织培养的方法，探讨了不同激素浓度配比对愈伤组织诱导、芽分化以及根再生的影响，并通过农杆菌介导法将编码獐茅液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(AINHX)导入将军菊苣中，建立农杆菌介导的将军遗传转化体系。结果表明:将军菊苣愈伤组织诱导和芽分化最佳培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA;最佳生根培养基为1/2MS+0.1mg/LNAA。获得的抗性芽经PCR检测，初步证实AINHX已插入到菊苣基因组中，统计得将军菊苣转化效率为13.3％。
　　这些研究结果为深入了解DREB基因调控植物胁迫应答反应的分子机理提供了理论基础，为研究菊苣的抗逆分子机理及抗逆基因工程提供科学依据，为利用基因工程的方法改良作物的抗逆性提供了条件。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 文献综述

1．1 植物抗逆分子机制

1．1．1 渗透调节

1．1．2 抗逆功能蛋白的保护作用

1．1．3 抗氧化防御系统

1．1．4 激素调节

1．1．5 应答胁迫的植物转录调控

1．2 转录因子及其在植物抗逆反应中的作用

1．2．1 植物逆境应答中的转录因子

1．2．2 植物中的抗逆转录因子信号转导途径

1．2．3 AP2／EREBP转录因子家族

1．2．4 DREB亚家族转录因子

1．2．5 DRE顺式作用元件

1．2．6 DREB转录因子的调控机理

1．2．6 DREB提高植物抗逆性的研究

1．3 菊苣基因工程研究进展

1．3．1 菊苣

1．3．2 菊苣遗传转化研究进展

1．3．3 农杆菌介导法

1．4 技术路线

第二章 将军菊苣DREB基因的克隆与表达分析研究

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果与分析

2．2．1 将军菊苣DREB基因的克隆

2．2．2 将军菊苣CiDREB基因的生物信息学分析

2．2．3 CiDREB基因表达模式分析

2．3 讨论

2．3．1 利用电子克隆的方法分离克隆将军菊苣DREB基因

2．3．2 将军菊苣DREB基因序列分析

2．3．3 将军菊苣DREB基因在不同胁迫条件下的表达模式分析

第三章 CiDREB蛋白功能研究

3．1 材料和方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 酵母单杂交结果分析

3．2．2 亚细胞定位结果分析

3．3 讨论

3．3．1 酵母单杂交分析CiDREB基因与DRE元件的结合能力分析

3．3．2 CiDREB蛋白的洋葱亚细胞定位分析

第四章 将军菊苣高频离体再生体系建立与农杆菌介导遗传转化

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 叶片愈伤组织的诱导

4．2．2 再生芽的分化

4．2．3 再生苗生根培养及炼苗移栽

4．2．4 卡那霉素(Kan)抗性植株的PCR检测

4．3 讨论

4．3．1 不同激素浓度配方对将军菊苣诱导愈伤组织及不定芽的影响

4．3．3 试验中对影响菊苣遗传转化效率几个条件进行了初步研究

全文结论

创新点

展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表与待发表论文

附录一

附录二

致谢