水稻细菌性条斑病菌中受DSF群体感应系统调控的外泌蛋白的功能研究

摘要

小分子DSF（DiffusibleSignalFactor）介导的群体感应(Quorumsensing，QS)系统在黄单胞菌的侵染和致病过程中具有关键作用，但DSF调控的外泌蛋白的种类和功能仍不清楚。由稻黄单胞菌稻生致病变种（Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，Xoc）引起的水稻细菌性条斑病是我国水稻生产上一种重要的细菌病害。本研究以Xoc为对象，研究受DSF调控的外泌蛋白的种类、致病功能及机制，研究结果如下:
　　（一）本实验室赵延存博士的前期研究中鉴定了Xoc中受DSF调控的53个外泌蛋白（赵延存论文，2011）。本研究选取了其中15个感兴趣的目标蛋白用于后续研究。这15个蛋白的功能涉及小分子蛋白介导的群体感应、细胞结构、细胞进程、氧化压力环境的适应、中间代谢、蛋白降解以及功能未知的蛋白。采用基因定向缺失技术，对这15个蛋白的编码基因进行敲除，获得相应的基因缺失突变株。致病性测定显示其中4个突变株显著削弱了Xoc对寄主水稻的致病性，其对应的蛋白/基因分别是XOC_0319（Ax21同系物，依赖XA21的水稻免疫激发子）、XOC_2128（多聚半乳糖醛酸酶）、XOC_3806（蛋白酶）和XOC_1601（半胱氨酸蛋白酶）。表型分析表明，这4个基因对Xoc的定殖能力、胞外多糖产量、游动性、生物膜的形成、胞外蛋白酶活性、抗氧化压力等毒力相关表型造成了不同程度的影响。具体结果如下:这4个基因的突变没有影响Xoc的生长速率，但影响了Xoc在水稻中接种发病后的定殖量，同时还均降低了胞外多糖的产量。XOC_2128和XOC_1601的突变减弱了菌体游动性，XOC_0319的突变减弱了生物膜的形成，XOC3806和XOC_1601的突变减弱了胞外蛋白酶活性，XOC3806和XOC_2128的突变使Xoc的抗氧化压力能力有所增强。荧光定量显示这四个基因在Rs105ΔrpfF的表达水平在一定程度上取决于培养基的营养状况，相关结果和Rs105ΔrpfF中差异蛋白表达情况不完全一致;同时我们还发现这四个基因对10个已知的致病相关基因存在一定的转录调控作用。xpsE是Ⅱ型分泌系统关键基因，荧光定量PCR还显示Rs105ΔrpfF中xpsE的转录表达水平显著下降，说明DSF群体感应系统对Ⅱ型分泌系统的功能存在某种程度的调控作用。此外，Ax21（水稻XA21先天免疫激发子）是Xoo泌出的能在依赖XA21的水稻上激发先天免疫的硫化蛋白，并且Ax21还被认为是Xoo中一种新型群体感应的信号分子;XOC_0319就是Ax21在Xoc的同系物，本研究说明这两种QS系统的功能很可能存在交叉和联系。本研究是黄单胞菌中第一次对受DSF介导的群体感应调控的外泌蛋白及其功能进行了系统深入分析，相关结果显示了DSF型群体感应系统对Ⅱ分泌系统毒力因子及AX21介导的群体感应有重要的调控作用，进一步明确了Xoc中DSF型群体感应系统的功能。
　　（二）病原菌在寄主表面的黏附性是其成功侵染的先决条件，主要在细菌黏附、定殖等侵染早期进程中起重要作用，而这个过程是由被称为黏性因子的蛋白质来完成的。因此我们选择了T5SS泌出的两个非菌毛黏性蛋白XadA、YapH进行研究，对相关基因xadA、yapH进行了缺失敲除，并对它们的致病机制及其与DSF型群体感应系统的关系进行了试验和分析。XadA和YapH是通过Ⅴ型分泌系统泌出的两个黏性蛋白。我们找到了xadA、yapH的同系物，即XOC3808、XOC_2467，然后构建了缺失突变体ΔxadA、yapH。致病相关表型的测定的结果显示这两个黏性蛋白均和Xoc的喷雾接种时的致病性、水稻叶片表面黏附性、胞外多糖合成能力相关，但与非生物表面的黏附性无关。实时定量荧光PCR表明，xadA、yapH的在模拟植物汁液的培养条件下的转录表达水平的变化存在差异，其中yapH能够被这种培养基诱导表达;xadA、yapH的转录表达受DSF型群体感应通路调控的模式不同，其中yapH受rpfF、clp正向调控，xadA受rpfF、clp负向调控，说明DSF群体感应系统很可能与外泌黏性蛋白功能的发挥密切相关。本研究首次为XadA、YapH在Xoc致病过程中的作用和特点提供了参考。

目录

声明

摘要

上篇 文献综述

第一章 水稻细菌性条斑病菌外泌毒性因子及相关的分泌系统

1 水稻细菌性条斑病菌外泌毒性因子

2 植物病原细菌毒性因子外泌途径

第二章 黄单胞菌群体感应调控系统

1 细菌群体感应信号分子主要类别

2 DSF介导的黄单胞菌群体感应调控系统

3 Ax21介导的黄单胞菌群体感应调控系统

下篇 研究内容

第一章 水稻细菌性条斑病菌中受DSF调控的4个毒力相关外泌蛋白的鉴定与功能研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二章 水稻细菌性条斑病菌中外泌黏性蛋白XadA和YapH的功能研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

攻读硕士学位期间发表的论文

参考文献

致谢

本论文研究受资助项目