黄体期高低饲喂水平影响湖羊卵泡发育的表达谱分析

摘要

研究指出，限饲会引起动物乏情。黄体期给予绵羊短期补饲可促进其卵泡的发育，提高排卵率;而在卵泡期给予补饲则无促排卵效应。本实验室的前期研究也表明，黄体溶解前短期限饲可抑制卵泡发育，黄体期提高营养水平可增强绵羊的卵泡发育能力。营养影响卵泡发育的分子机理目前尚不清楚。因此，探寻黄体期高低饲喂影响湖羊卵泡发育的差异表达基因及其功能和分子调控网络，对于规模化羊场母羊的科学饲养管理、了解湖羊黄体期的激素分泌特点，以及对营养影响湖羊繁殖性能的分子调节机理的深入研究具有重要意义。
　　颗粒细胞在卵母细胞的营养供给和成熟中发挥着至关重要的作用。为了调查基因的表达水平及其与卵泡发育的关系，本研究对黄体期高饲喂组（H组，1.5×M）和低饲喂组（L组，0.5×M）各8只共计16只湖羊进行屠宰，取卵巢后分组剥离直径＞2.5mm卵泡的颗粒细胞，提取RNA，进行表达谱测序，筛选出170个显著差异表达的基因。为了研究基因的功能和表达模式，本试验又进一步做了GO和KEGG通路分析，以及表达模式聚类分析。研究结果如下:
　　1.试验中对两组高低饲喂水平湖羊的颗粒细胞提取RNA，进行了Illumina表达谱测序，最终获得了大约2.4 Gb高质量的测序数据(clean data)，包括了49，139，471条读长(clean reads)。这些数字为后续基因表达量的定量分析提供了充足的数据。与参考基因组比对后，L组和H组分别匹配上了24，259，559条(91.81％)和20，777，451条(91.47％)，匹配结果良好。在两组基因库中总共检测到了18，468个可匹配的表达基因（a cut-off FPKM＞0），说明测序数据涵盖了大部分的转录组序列。其中，在两组中共同表达的有16，523个基因。通过FDR＜0.05条件筛选，有170个基因显示出差异显著性，包括140个上调基因和30个下调基因。并对PRL、CXCR4、CD44、CYP19A1、IGFBP-1和17β-HSD2等繁殖相关基因的表达量进行了讨论。表达谱测序为调查湖羊卵泡发育的分子机制提供了大量的遗传信息资源，为基因表达差异分析提供了可靠的基础数据。
　　2.18，468个检测基因经过GO富集分析和注释，有15，278个基因可富集到60个功能类。经过KEGG通路富集分析，有6，361个基因可注解到312个KEGG生物学通路。170个显著差异基因经过GO富集分析和注释，被分类为47个功能组;经过KEGG通路分析，富集到了120个KEGG通路。在这些通路中，发现了一些基因富集到生殖调节通路，比如P450细胞色素代谢(Metabolism of xenobiotics bycytochrome)、卵母细胞减数分裂(Oocyte meiosis)、GnRH信号通路(GnRHsignaling pathway)、孕酮调节卵母细胞成熟(Progesterone-mediated oocytematuration)和类固醇激素生物合成(steroid hormone biosynthesis)等通路。
　　结合GO和KEGG通路分析结果，试验发现了五个与卵泡发育关系密切的重点研究基因:PTGS2、UCP2、STAR、IL1A和IL1B基因，并对富集到与卵泡发育和成熟相关通路的上调基因ADCY7和CYP2S1进行了简单的讨论。GO分析和KEGG通路分析为湖羊颗粒细胞表达基因的功能和参与的生物学通路提供了大量可靠有用的依据。
　　3.170个显著差异基因可聚类到十个表达聚类基因簇，并分别对十个基因簇的聚类模式进行了描绘。结果发现，PTGS2、UCP2和STAR基因聚类到subcluster1，IL1A和IL1B基因聚类到subcluster3。说明这两组上调基因的表达模式分别具有相似性，并都与卵泡发育相关。本试验对这五个基因的表达量进行了FPKM比较分析和qRT-PCR验证，两种结果一致:这五个基因均在黄体期短期高饲喂组（H组）中呈现高表达。结果表明，PTGS2、UCP2、STAR、IL1A和IL1B可能是黄体期高饲喂量促进湖羊卵泡发育的重要基因。
　　本研究为调查黄体期高低饲喂水平影响湖羊颗粒细胞基因的差异表达，以及湖羊卵泡发育的分子机制提供了重要的遗传信息资源。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 营养影响绵羊卵泡发育的研究及表达谱测序技术

1 卵泡的发育和闭锁

1．1 卵泡的发育和排卵

1．2 卵泡的募集、选择和优势化

2 卵泡发育的调控

2．1 生殖激素对卵泡发育的调节

2．2 卵巢内因子对卵泡发育的调节

3 颗粒细胞与卵泡的发育和闭锁

3．1 颗粒细胞与卵泡发育

3．2 颗粒细胞与卵泡闭锁

4 黄体期营养对卵泡发育的影响

4．1 黄体期短期饲喂对卵泡发育的影响

4．2 黄体期短期饲喂对卵泡波的影响

5 表达谱测序及分析技术

5．1 表达谱测序

5．2 GO分析

5．3 KEGG通路分析

5．4 聚类分析

参考文献

第二章 黄体期高低饲喂处理的湖羊卵泡颗粒细胞的表达谱分析

1 试验材料与方法

1．1 道德声明

1．2 试验动物及饲养管理

1．3 试验设计

1．4 试验材料

1．5 颗粒细胞的收集

1．6 颗粒细胞RNA提取和质量检测

1．7 cDNA建库和Illumina测序

1．8 数据去杂及与参考基因组比对

1．9 表达水平标准化及差异基因分析

2 结果与分析

2．1 Illumina测序及质量检控

2．2 参考基因组比对结果

2．3 基因表达量的分析

2．4 基因表达的差异分析

3 讨论

4 小结

参考文献

第三章 基因的GO分析与KEGG通路分析

1 试验材料和方法

1．1 分析对象

1．2 软件工具

1．3 数据库

1．4 分析方法

2 结果

2．1 GO分析与KEGG分析结果统计

2．2 检测基因的GO分析

2．3 检测基因的KEGG分析

2．4 显著差异表达基因的GO注解以及富集分析

2．5 显著差异表达基因的KEGG注解以及富集分析

2．6 GO分析与KEGG通路分析结合比对

3 讨论

3．1 ADCY7与三个繁殖通路

3．2 CYP2S1与细胞色素P450新陈代谢通路

3．3 PTGS2与花生四烯酸代谢通路

3．4 IL1A、IL1B与MAPK信号通路

4 小结

参考文献

第四章 差异基因的表达模式聚类分析及qRT-PCR验证

1 试验材料和方法

1．1 试验材料

1．2 聚类分析

1．3 qRT-PCR验证

2 结果

2．1 FPKM聚类分析

2．2 FPKM倍数变化的聚类分析

2．3 qRT-PCR验证结果

3 讨论

4 小结

参考文献

全文结论

创新点

作者简介

攻读硕士学位期间发表论文

致谢