脱氢表雄酮在雌性大鼠体内生物转化规律及其机制的研究

摘要

类固醇激素是动物体内胆固醇重要的代谢产物，在调控动物的各种生理学功能中发挥十分重要的作用。脱氢表雄酮(Dehydroepiandro sterone，DHEA)是胆固醇代谢在肾上腺和性腺组织中重要的中间产物之一。本实验室前期研究表明，DHEA可明显调节成年和老年雄性大鼠体内各种类固醇激素的含量及类固醇代谢关键酶的表达，尤其明显促进动物机体内雄激素和雌激素的分泌。但是关于在雌性成年动物体内性腺组织的生物转化规律还不清楚。卵巢是雌性动物体内甾体类激素的主要内分泌器官，其中大部分性激素（雌激素、雄激素和孕激素）的合成主要是由卵泡内的颗粒细胞和膜细胞完成。在肾上腺和卵巢组织中，雄激素的主要合成步骤为β-HSD催化DHEA转化为Δ4-雄烯二酮，17β-HSD进而使Δ4-雄烯二酮转化为睾酮;而雌激素主要是由经颗粒细胞中的Aromatase催化睾酮和雄烯二酮转化生成雌二醇和雌酮，由芳香化酶催化的这一步是雌激素合成的主要限速阶段。DHEA对雌性动物各种生理学机能的调节作用，尤其是对女性内分泌的调节及在维持健康状态中所起的作用引起了人们的广泛关注。已有研究表明，DHEA发挥其生学物功能主要是通过在体内转化为活性类固醇激素，但DHEA在雌性动物体内的生物转化规律、其生物转化的主要靶组织均还不是很清楚，代谢转化过程中这三种类固醇激素合成酶在成年雌性大鼠体内中的变化如何，动态生物转化以及消长关系的研究很少，具体的调控机制如何，目前尚未完全明了。因此，本文以正常和去卵巢成年雌性大鼠为研究对象，探讨DHEA对雌性大鼠体内各种类固醇激素含量及特定靶组织中关键酶基因表达的影响;并采用机械分离法分离培养原代大鼠卵巢颗粒细胞，研究DHEA在特定的靶细胞中的生物转化及关键酶表达规律的变化，旨在揭示DHEA在正常生殖期雌性动物体内生物转化模式和细节，以期为促进动物健康养殖和人类相关疾病的防控提供理论依据。
　　1.脱氢表雄酮对雌性大鼠体内类固醇激素含量及其代谢途径关键酶表达的影响
　　本实验以正常成年雌性大鼠为研究对象，探讨外源性DHEA对雌性大鼠体内的类固醇激素含量及肾上腺和卵巢中相关类固醇激素代谢关键酶mRNA水平的影响。实验选用清洁级雌性SD大鼠70只，随机分对照组和DHEA处理。处理组一次性按25mg/kg·WB灌胃DHEA（溶解于10％ DMSO中），对照组灌胃等量的DMSO溶液。各处理组分别于灌胃后0h，3h，6h，12h，24h和48 h宰杀大鼠，收集血清待测，收集肾上腺和卵巢-80℃保存。用放射免疫法测血清中雄烯二酮，雌二醇，睾酮，孕酮，皮质醇，醛固酮含量变化;Realtime-PCR法检测卵巢和肾上腺3β-HSD、17β-HSD和Aromatase mRNA表达水平。试验结果表明，与对照组相比，DHEA处理后血清雄烯二酮在3-12h内均极显著升高(P＜0.01)，12-48 h内均显著升高(P＜0.05)其含量在3h达到最大值，较同时间点的对照组增加了165％;血清睾酮含量在DHEA处理后3-6 h极显著高于对照组(P＜0.01)，其含量也在3h达到最大值，较同时间点的对照组增加了8000％。血清雌二醇含量则在DHEA处理后的6h极显著升高(P＜0.01)，且达到最大值，较同时间点的对照组增加了113％，雌酮和孕酮含量在48 h内均无显著变化。与对照组相比，DHEA处理后血清皮质醇含量在3h显著升高（P＜0.05），而后逐渐降低，在24 h则显著低于对照组(P＜0.05);血清醛固酮含量在6h显著升高(P＜0.05)。类固醇激素代谢关键酶mRNA表达分析结果表明，与对照组相比，DHEA处理后肾上腺组织中3β-HSD和17β-HSD mRNA表达水平在3-12 h显著升高(P＜0.05)，而Aromatase mRNA表达水平在DHEA处理后的3h和12h显著高于对照组(P＜0.05);在卵巢组织中DHEA处理后3β-HSD mRNA表达水平在3和12h极显著下降（P＜0.01），6h显著下降(P＜0.05);17β-HSD mRNA表达水平仅在12h极显著低于对照组(P＜0.01)，而Aromatizes mRNA表达水平在3h极显著降低(P＜0.01)，6h极显著升高(P＜0.01)，12h再次极显著降低(P＜0.01)，之后在24-48 h再次极显著上升（P＜0.01），其在3-12 h内变化趋势与肾上腺中Aromatase mRNA表达趋势正好相反。
　　以上结果提示，外源性DHEA可以显著升高正常雌性大鼠体内的雄激素（雄烯二酮和睾酮）、雌激素（雌二醇）和肾上腺皮质激素（皮质醇和醛固酮）的含量;DHEA在雌性大鼠体内的生物转化主要是优先向雄激素而不是雌激素转化，且其主要是通过促进肾上腺3β-HSD和17β-HSD的mRNA表达促使其向雄激素转化。
　　2.脱氢表雄酮对去卵巢大鼠体内类固醇激素含量及其代谢途径关键酶的影响
　　本试验以去卵巢大鼠为研究对象，探讨DHEA对去卵巢大鼠血清中类固醇激素含量及肾上腺中代谢关键酶表达水平的影响。试验选用30只清洁级雌性大鼠，随机分为假手术组(SO)、去卵巢模型组（OVX-control）和DHEA+去卵巢处理组(OVX+DHEA)。DHEA处理组一次性按25mg/kg·WB DHEA（溶解于10％ DMSO中）灌胃，其余两组灌胃等量的DMSO溶液，并于处理6h后处死大鼠，采集血清和肾上腺保存，待测。试验结果表明，与SO组比较，OVX-control组血清雌二醇、孕酮和雌酮含量均显著降低（P＜0.05）;而血清雄烯二酮类、睾酮、皮质醇和醛固酮的含量则无显著性变化(P＞0.05)。与OVX-control组相比，OVX+DHEA处理组血清雄烯二酮和睾酮含量极显著升高(P＜0.01);而血清雌二醇、雌酮、孕酮、皮质醇和醛固酮的含量则无显著性变化(P＞0.05)。肾上腺类固醇激素代谢关键酶的mRNA表达变化分析结果表明，与SO组比较，3β-HSDmRNA表达水平显著升高(P＜0.05)，而17β-HSD和Aromatase mRNA表达水平则无显著变化（P＞0.05）;与OVX-control组比较，OVX+DHEA处理组3β-HSD mRNA表达水平极显著升高（P＜0.01），17β-HSDmRNA表达水平显著升高(P＜0.05)，而Aromatase mRNA表达水平则极显著降低(P＜0.01)。
　　以上结果提示，外源性DHEA可以显著升高去卵巢大鼠体内的雄激素（雄烯二酮和睾酮）的含量，而对雌激素（雌二醇、雌酮和孕酮）和肾上腺皮质激素（醛固酮和皮质醇）的含量没有明显的影响，且其对雄激素含量影响的主要机制是通过促进肾上腺3β-HSD和17β-HSD的mRNA表达，抑制Aromatase mRNA的表达水平实现的。
　　3.脱氢表雄酮对原代大鼠颗粒细胞激素生成和代谢关键酶的影响
　　探讨脱氢表雄酮对原代大鼠卵巢颗粒细胞激素生成及相关甾体生成酶的影响。采用机械法分离法分离原代大鼠卵巢颗粒细胞进行体外分离培养。先以梯度浓度(0、0.1、1.0、10、100μmol/L)加入DHEA，确定适合继续研究的DHEA浓度;放射免疫法检测并对比实验组(DHEA)和空白对照组培养上清液中孕酮和睾酮的浓度;Real-time PCR法检测类固醇代谢途径中3β-HSD、17β-HSD、Aromatase mRNA的表达变化。试验结果表明，10μmol/L DHEA处理48 h后可极显著促进大鼠卵巢颗粒细胞雌二醇、孕酮和睾酮的分泌量(P＜0.01)，显著促进3β-HSD(P＜0.01)和17β-HSD(P＜0.05) mRNA的表达，Aromatase mRNA有降低的趋势，但没有明显变化。
　　以上试验结果提示，外源性DHEA能直接作用于原代大鼠卵巢颗粒细胞，通过作用于3β-HSD、17β-HSD、Aromatase mRNA等相关酶的基因表达而影响颗粒细胞雌激素（雌二醇和孕酮）和雄激素（睾酮）的分泌。

目录

声明

摘要

本文部分缩写中英文对照

引言

第一章 雌性动物体内类固醇激素的代谢及其调控

1 雌性体内类固醇激素生物合成的特点

2 雌性动物体内类固醇激素的代谢

2．1 卵巢类固醇激素的生物合成代谢

2．2 肾上腺皮质类固醇激素的生物合成代谢

2．3 类固醇激素在雌性动物体内的分解代谢

3 类固醇激素代谢关键酶的研究进展

3．1 HSDs家族的基因结构及功能

3．2 芳香化酶

4 类固醇激素调节机体生理功能的作用机制

4．1 基因组机制

4．2 快速非基因组作用

参考文献

第二章 脱氢表雄酮生物学功能研究进展

1 DHEA的合成、代谢与分布

2 DHEA的生物学功能

2．1 DHEA对生殖系统的影响

2．2 DHEA与物质代谢

2．3 DHEA与抗氧化作用

2．4 DHEA对中枢神经系统的影响

2．5 DHEA对免疫系统的影响

2．6 DHEA对心血管系统的影响

2．7 DHEA对骨质代谢的影响

3 DHEA调节机体生物功能的作用机制

3．1 DHEA的间接作用

3．2 DHEA的直接作用

参考文献

第三章 脱氢表雄酮对雌性大鼠体内类固醇激素含量及其代谢途径关键酶表达的影响

1．材料和方法

1．1 主要试剂和仪器

1．2 实验动物和饲养

1．3 实验设计及样品采集处理

1．4 内分泌激素含量测定

1．5 Real-time PCR法测定卵巢和肾上腺类固醇激素合成关键酶mRNA表达水平

1．6 数据统计分析

2 结果与分析

2．1 DHEA对雌性大鼠血清雄烯二酮和睾酮含量的影响

2．2 DHEA对雌性大鼠血清雌二醇、雌酮和孕酮含量的影响

2．3 DHEA对雌性大鼠血清皮质醇和醛固酮含量的影响

2．2 DHEA对卵巢类固醇激素合成关键酶mRNA表达水平的影响

2．3 DHEA对肾上腺类固醇激素合成关键酶mRNA表达水平的影响

3 讨论与小结

3．1 讨论

3．2 小结

参考文献

第四章 脱氢表雄酮对去卵巢大鼠体内类固醇激素含量及其代谢途径关键酶的影响

1 材料与方法

1．1 主要试剂和仪器

1．2 实验方法

1．3 内分泌激素含量测定

1．4 Real-time PCR法测定肾上腺类固醇激素合成关键酶mRNA表达水平

1．5 数据统计分析

2 结果与分析

2．1 DHEA对去卵巢大鼠血清雄烯二酮和睾酮含量的影响

2．2 DHEA对去卵巢大鼠血清雌二醇和雌酮含量的影响

2．3 DHEA对去卵巢大鼠血清孕酮含量的影响

2．4 DHEA对去卵巢大鼠血清皮质醇和醛固酮含量的影响

2．5 DHEA对去卵巢大鼠肾上腺类固醇激素合成关键酶表达水平的影响

3 讨论与小结

3．1 讨论

3．2 小结

参考文献

第五章 脱氢表雄酮对原代大鼠卵巢颗粒细胞激素生成和代谢关键酶的影响

1．材料与方法

1．1 主要试剂和仪器

1．2 实验动物

1．3 原代大鼠卵巢颗粒细胞雌二醇的基础分泌量的测定

1．5 DHEA对原代大鼠卵巢颗粒细胞细胞雌二醇分泌量的影响

1．6 DHEA对原代大鼠卵巢颗粒细胞细胞睾酮和孕酮分泌量的影响

1．7 Real-time PCR法测定原代大鼠卵巢颗粒关键酶mRNA表达水平

1．8 数据统计分析

2 结果与分析

2．1 原代大鼠卵巢颗粒细胞的细胞形态学观察及FSHR免疫组织化学鉴定

2．2 原代大鼠卵巢颗粒细胞雌二醇的基础分泌量

2．3 DHEA对原代大鼠卵巢颗粒细胞分泌雌二醇影响的剂量效应

2．4 DHEA对原代大鼠卵巢颗粒细胞分泌雌二醇影响的时间效应

2．5 DHEA对原代大鼠卵巢颗粒细胞睾酮和孕酮分泌量的影响

2．6 DHEA对原代大鼠卵巢颗粒细胞类固醇代谢关键酶mRNA表达的影响

3 讨论与小结

3．1 讨论

3．2 小结

参考文献

全文结论

致谢

攻读硕士学位期间论文发表与学术交流情况