植物内生细菌对多环芳烃污染响应及菲降解内生细菌的筛选

摘要

土壤是人类生存和发展的重要基础，由土壤有机污染引起的植物污染风险已经成为全球关注的热点问题之一。多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一类普遍存在于土壤环境中具有致畸、致癌、致突变特性的持久性有机污染物，能够被植物吸收积累，并通过食物链的传递严重危害动物和人体健康。因此，如何规避植物体内PAHs污染风险，保障农业的健康、可持续发展亟需解决。菲、芘作为PAHs中三环和四环污染物的典型代表，常被用作测定环境中PAHs污染的指示物和PAHs生物降解的模型分子。
　　本研究以菲、芘作为PAHs代表性污染物，以黑麦草作为供试植株，探讨PAHs复合污染条件下，植物体内可培养内生细菌的种群数量变化及其菲、芘降解效能，阐明植物内生细菌对PAHs污染的响应，并进一步从PAHs污染场地的健康植株体内分离筛选出具有PAHs降解特性的功能内生细菌，系统地研究其生物学特性及不同环境因子对PAHs的降解效能，以期为利用功能内生细菌调控植物吸收降解PAHs，进而有效地规避植物体内PAHs污染风险提供新思路和途径。主要研究成果如下:
　　1植物内生细菌对多环芳烃污染的响应
　　(1)黑麦草能够吸收培养液中的PAHs，并由根向茎叶传导。植物体内PAHs浓度随着培养液中PAHs污染强度的增加而显著增加，并且根中PAHs浓度显著高于茎叶。当培养液中菲浓度由0.1增加到0.8 mg·L-1时，植物根、茎叶中菲含量分别由57.0和19.3 mg·kg-1增加到346.5和144.7 mg·kg-1。当培养液中芘浓度由0.02增加到0.5mg·L-1时，植物根、茎叶中芘含量分别由31.3和0.6 mg·kg-1增加到630.7和184.7mg·kg-1。
　　(2) PAHs污染改变了黑麦草体内可培养内生细菌的种属数量和优势种群。本研究从不同菲和芘污染的黑麦草体内共分离筛选出33种可培养植物内生细菌，分别属于Gamma Proteobacteria、Sphingobacteda、 Alpha Proteobacteria、Bacilli、Flavobacteria、Beta Proteobacteria、Actinobacteria7个类群。此外，改变菲、芘浓度均能够影响植物体内可培养内生细菌的种属数量和优势种群。随着菲污染浓度的增加，植物体内可培养内生细菌的种属数量有所减低，其优势种群由Rhizobium sp.，Klebsiella sp.和Stenotrophomonas sp.转变为Pantoea sp.，Bacillus sp.和Enterobacter sp.。
　　(3) PAHs污染条件下，植物内生细菌在体外对菲、芘具有不同程度的降解能力。其中Gamma Proteobacteria类群中的9种内生细菌对菲的降解能力高达90％以上，Bacillus类群中的Serratia sp.和Bacillus sp.2种内生细菌对芘的降解率为33.9-49.4％。
　　2菲降解功能内生细菌的分离筛选及其广谱性分析
　　(1)采用富集培养法，从南京某PAHs污染场地的健康植物车前草（PlantagoasiaticaL.）体内分离筛选出10株对菲具有耐受性的功能内生细菌。其中菌株PHE-3能以菲为唯一能源和碳源进行生长，96h内对菲的降解率高达99％以上。结合菌株PHE-3的菌落形态观察、生理生化特性和16S rRNA序列分析，初步鉴定为类芽孢杆菌属（Paenibacillus sp.）。该茵对多种抗生素较为敏感，仅对低浓度的氨苄青霉素具有一定的抗性。
　　(2)改变环境条件能够影响菌株PHE-3对菲的降解效果。当pH4.0-8.0时，菌株PHE-3对菲的降解率高达99％;当温度30-42℃时，菌株PHE-3对菲的降解率达90％以上。同时，随着菲污染浓度的升高，菌株PHE-3对菲的降解率逐渐降低。当菲浓度为25-50 mg·L-1时，菌株PHE-3对菲降解率为93.6％-99.0％;当菲浓度为100-300 mg·L-1时，菌株PHE-3对菲的降解率为11.8％-76.9％。此外，添加C、N源能够促进菌株PHE-3对菲的降解效果。当外加C源为柠檬酸和硫酸铵，N源为硝酸铵，或外加混合C、N源为谷氨酸和酵母膏时，菌株PHE-3在84 h内几乎能完全降解菲。
　　(3)菌株PHE-3对6种PAHs具有普遍的降解能力，且能够以低分子量PAHs为碳源，通过共代谢作用增加高分子量PAHs的降解作用。当菌株PHE-3分别以萘、芴、菲、芘、荧蒽、苯并[a]芘为唯一碳源时，7d内，其降解率分别为48.9％，59.4％，100.0％，24.2％，24.4％和22.1％;当菌株PHE-3以萘、芴、菲、芘、荧蒽、苯并[a]芘为混合碳源时，7d内可降解51.8％萘、48.2％芴、60.1％菲、44.0％芘、53.2％荧蒽和57.7％苯并[a]芘。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 植物体内多环芳烃污染风险

1．2．1 植物体内PAHs污染来源

1．2．2 植物体内PAHs污染危害

1．2．3 植物吸收降解PAHs的调控机制

1．3 植物体内生细菌

1．3．1 植物内生细菌的多样性

1．3．2 植物内生细菌的生物学特性

1．3．3 植物内生细菌的分离筛选及其鉴定

1．4 具有PAHs降解特性的功能内生细菌

1．4．1 功能内生细菌对有机污染物的降解

1．4．2 功能内生细菌在植物体内的定殖

1．4．3 功能内生细菌调控植物体内有机污染物的降解机制

1．5 问题与展望

1．6 研究目标及技术路线

第二章 黑麦草体内可培养内生细菌种群结构对菲芘复合污染的响应

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．1．3 数据处理

2．2 结果与分析

2．2．1 植物样品中菲芘含量

2．2．2 植物体内可培养内生细菌的种群结构

2．2．3 植物体内可培养内生细菌对菲、芘的降解效能

2．3 结论

第三章 具有菲降解特性的功能内生细菌的分离筛选及其生物学特性

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 培养基

3．1．3 具有菲降解特性的功能内生细菌的分离筛选

3．1．4 菌悬液制备

3．1．5 功能内生细菌的生长和菲降解曲线

3．1．6 功能内生细菌的生物学特性

3．1．7 菌种鉴定

3．1．8 数据处理

3．2 结果与分析

3．2．1 功能内生细菌的鉴定

3．2．2 功能内生细菌的生长和菲降解曲线

3．2．3 抗性试验

3．3 结论

第四章 菲降解菌株PHE-3的降解条件优化及其广谱性分析

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 菌悬液制备

4．1．3 菌株PHE-3对菲的降解条件优化

4．1．4 菲浓度对菌株PHE-3降解菲的影响

4．1．5 添加碳、氮源对菌株PHE-3降解菲的影响

4．1．6 菌株PHE-3对单一PAH的降解效能

4．1．7 菌株PHE-3对混合PAHs的降解效能

4．1．8 PAHs测定

4．1．9 数据分析

4．2 结果与分析

4．2．1 环境条件对菌株PHE-3菲降解效能的影响

4．2．2 菲浓度对菌株PHE-3菲降解效能的影响

4．2．3 碳、氮营养对菌株PHE-3菲降解效能的影响

4．2．4 菌株PHE-3对单一PAH降解效能

4．2．5 菌株PHE-3对混合PAHs降解效能

4．3 结论

第五章 总结与展望

5．1 总结

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢