禾谷丝核菌基因组大小的预测及系统发育学分析

摘要

丝核菌属（Rhizoctonia）真菌类群繁多、分布范围广泛，大部分类群为植物病原菌，可引发多种严重植物病害。其中，禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）可以导致小麦纹枯病，是该病的主要病原菌。
　　菌丝融合群（anastomosis group）是丝核菌最经典的分类方法。目前为止，多核丝核菌共分为14个融合群，双核丝核菌共分为21个融合群。其中禾谷丝核菌是双核丝核菌，属于AG-D融合群。目前对该菌的基因组序列还无报道，对其系统发育学研究也需进一步深入。因此本研究利用实时定量PCR绝对定量的方法对禾谷丝核菌标准菌株R0301的基因组大小进行了预测，并利用翻译延伸因子(translation elongationfactor, tef)基因序列对禾谷丝核菌和其他丝核菌融合群进行了系统发育分析，为今后研究禾谷丝核菌的基因组奠定基础。
　　首先用真菌tefA基因通用引物对分离自江苏南京的强致病力禾谷丝核菌R0301菌株的基因组进行了扩增，对克隆测序得到的序列进行Blast分析，结果表明该序列确为禾谷丝核菌的tefA基因序列。应用Southern杂交方法证明了tefA基因在禾谷丝核菌基因组中是单拷贝。
　　利用实时定量PCR绝对定量的方法对已进行全基因组测序的多核立枯丝核菌AG-1-IA标准菌株GD118、AG-1-IB标准菌株7/3/14进行基因组大小的预测。以绝对定量的标准品制作标准曲线，PCR扩增标准菌株的tefA基因进行定量，依据Wilhelm提出的公式计算得到两株标准菌株的基因组大小。该方法预测的结果与基因组测序拼接的基因组大小较接近。结果表明实时定量PCR方法适用于多种真菌进行基因组大小的预测，也可以用于丝核菌的基因组大小预测。
　　实时定量PCR技术可作为一种快速、简便的方法来预测丝核菌基因组大小。本研究利用实时定量PCR技术对禾谷丝核菌R0301菌株进行了基因组大小的预测，首次预测了禾谷丝核菌的基因组大小位于32.2-36.6 Mb。本研究运用实时荧光定量PCR技术首次预测了禾谷丝核菌的基因组大小，对于物种分类、鉴定、系统发育和其致病机制等方面有重要意义，也为全基因组的测序和拼接奠定了一定的基础。
　　从山东、河南、河北和安徽等地小麦田采集分离的18株禾谷丝核菌株及其他融合群的11株标准菌株的tefA基因序列进行了克隆，并挑选阳性克隆进行测序，将这些菌株的tefA基因序列进行了遗传进化分析。克隆测序和PCR产物测序得到的序列一致，且不同克隆间的序列不存在多态性。系统发育树显示，tefA可以很好地区分丝核菌的融合群和融合亚群，且同一融合群及同一菌株之间没有异质性，可作为丝核菌分类鉴定的分子标记。
　　扩增丝核菌同一融合群不同菌株的tefB基因序列，将PCR纯化产物进行克隆测序，并对得到的序列进行了系统进化分析。系统发育分析显示，tefB可以很好地区分丝核菌与其他伞菌纲真菌，但是同一融合群间的菌株具有遗传多样性，序列保守性不及tefA基因。
　　最后，依据tefA基因序列和翻译的氨基酸序列，分析了该基因的结构特征，并按照氨基酸序列预测了二级和三级结构，tefA的二级结构是以卷曲和α-螺旋为主要的结构元件，没有β-折叠和β-转角结构;其目标蛋白序列与模型序列的相似度很高，可认为目标蛋白的三维结构与模型三维结构基本相似。
　　本研究通过Southern杂交技术确定了禾谷丝核菌体内tefA基因为单拷贝，应用实时定量PCR技术预测了禾谷丝核菌的基因组大小。利用tef基因对不同融合群的丝核菌系统发育学分析结果表明tefA可以很好地区分丝核菌的融合群和融合亚群，且同一融合群及同一菌株之间没有异质性，tefB可以很好地区分丝核菌与其他伞菌纲真菌，但是同一融合群间的菌株具有遗传多样性。研究结果为今后探索tef基因作为丝核菌分类鉴定的分子标记奠定了重要基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 小麦纹枯病的研究进展

1．1 小麦纹枯病的分布和危害

1．2 病原菌

1．3 侵染过程及发病症状

1．4 小麦纹枯病的发生规律以及影响因素

1．5 小麦纹枯病的防治措施

2 真核生物基因组学研究进展

2．1 真核生物基因组的测序技术

2．2 真核生物基因组大小进化的研究进展

2．3 比较基因组学与进化分析

3 丝核菌的遗传多样性研究进展

3．1 生化技术在丝核菌遗传多样性研究中的应用

3．2 DNA分子标记在丝核菌的遗传多样性的应用

4 本研究的主要内容及其意义

参考文献

第二章 实时定量PCR法预测禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis基因组大小

前言

1 材料和方法

1．1 供试菌

1．2 DNA提取

1．3 tefA基因部分序列的克隆和测序

1．4 探针制备

1．5 Southern blot分析

1．6 Real-time qPCR

1．7 基因组大小的计算

2 结果与分析

2．1 禾谷丝核菌R0301 tefA基因部分序列的测定

2．2 探针制备结果

2．3 基因组DNA酶切结果

2．4 禾谷丝核茵基因组中tefA基因拷贝数

2．5 实时定量PCR引物的特异性

2．6 标准菌株的扩增

2．7 禾谷丝核菌实时定量PCR

2．8 禾谷丝核菌基因组大小的预测

3 讨论

参考文献

第三章 不同融合群丝核菌的系统发育学分析

前言

1 材料和方法

1．1 纹枯病菌菌株

1．2 真菌基因组DNA的提取

1．3 真菌基因组DNA PCR扩增的引物设计及扩增测序

1．4 tefA基因的多态性分析

1．5 系统发育学分析

1．6 tefA基因的结构预测

2 结果与分析

2．1 同一菌株和同一融合群的tefA多态性研究

2．2 菌株的系统发育学分析

2．3 tefA基因的结构和功能预测

3 讨论

参考文献

全文结论

攻读硕士期问发表的学术论文

致谢