辣椒疫病抗性基因QTL定位及挖掘

摘要

辣椒是世界五大蔬菜之一，可用作蔬菜、调料、色素、药用等用途。它的种植面积十分广泛，仅次于大白菜居第二位，但其产值却居第一位。辣椒原产中南美洲，主要有五大栽培种。其中C.annuum是最为重要的一个栽培种种，它能同时在热带和温带地区生长，而且具有多样化的特性。相比而言，其余四大种则只能在特定的环境下生长或只能在热带地区生长，并且大多用来做调料。辣椒疫病Phytophthora capsici.L）是世界性病害，严重影响辣椒的产量和品质。本试验以辣椒高抗疫病材料PI201234和高感疫病材料G29及其构建的F2群体为研究试材，采用前人筛选的EST-SSR引物，使用SSR分子标记技术构建遗传连锁图谱，并结合F2群体的抗疫病生物学鉴定，对辣椒抗疫病性进行相关QTL定位，同时还对F2构建的抗、感基因池进行了转录组测序分析。主要结论如下:
　　1.辣椒抗疫病鉴定
　　本试验采用游动孢子灌根法进行辣椒抗疫病鉴定。病原菌为江苏淮安地区分离株，属于生理小种Ph1。在PDA上活化后转入V8培养基，28℃黑暗条件下培养5～7d后，长日照培养2～3 d以诱导产生孢子囊，然后加入无菌水，4℃放置40 min后室温30 min释放游动孢子，制备浓度为1×104个/mL的孢子悬浮液。以辣椒高抗疫病材料PI201234和高感疫病材料G29为亲本构建F2群体，在6～8叶期进行游动孢子灌根接种，每株20 mL，塑料薄膜保湿24 h后转移至人工气候箱，在温度28℃，相对湿度90％，光照4000lx，12 h/d的条件下培养促使发病。接种15d后统计结果表明，发现辣椒发病趋势呈现偏正态分布，其中0级辣椒10株，1级辣椒16株，2级辣椒30株，3级辣椒33株，4级辣椒31株，5级辣椒28株。
　　2.辣椒抗疫病遗传连锁图谱的构建
　　以抗疫病材料PI201234和感疫病材料G29构建的F2群体为作图群体，利用EST-SSR分子标记构建遗传连锁图谱。首先利用抗、感亲本对664对EST-SSR引物组合进行筛选，共获得了具有多态性的引物114对，再经过F2部分单株验证，选取65对多态性稳定、条带清晰的引物组合对F2进行基因分型。应用JoinMap4.0软件对结果进行分析，以LOD值≥2作为阈值，利用“Kosambi”作图函数，构建了一张包含10个连锁群，49个EST-SSR标记的辣椒遗传连锁图谱。连锁群总长度为418.6 cM，平均每个连锁群上标记数在2～12个之间，两标记间的平均遗传距离为8.55 cM。
　　3.辣椒抗疫病相关QTL定位
　　运用MapQTL4.0软件的复合区间作图法进行QTL分析。在构建的辣椒遗传连锁图谱的基础上结合抗疫病生物学鉴定，在N3连锁群上检测到1个QTL位点，该QTL位点LOD值为2.45，在连锁群上的支持区域是0～5.0 cM，距离最近的标记ESTSSR451是5.0 cM，可解释表型差异的贡献率为14.9％。
　　4.辣椒转录组测序分析
　　辣椒总RNA纯化得到mRNA，打断mRNA反转录成不同片断大小的DNA，用IIumina HiseqTM2000进行测序。再利用原始reads（双端序列）组装该物种的UnigeneLibrary(Unigene库)，基于Unigene库进行基因结构注释、基因表达分析、基因功能注释等。测序共获得44.6 Gb数据量，其中reads数220，810，807条，CycleQ20达到100％。Unigene中有77，333条，基因表达注释分析中，93，307条Unigene注释到NR数据库;86，638条注释到NT数据库;55，955条释到Swiss-Prot数据库;49，247条注释到KEGG数据库;28，925条注释到GOG数据库;73，831条注释GO数据库，丰富了陆地棉黄萎病菌诱导的的转录组信息。并对其中22043-2303bp序列和25545反序列进行了核苷酸和蛋白质BLAXT分析，结果表明，这两个序列与马铃薯抗病基因有较大程度的同源性。

目录

声明

摘要

缩略语表

引言

第一章 文献综述

1 辣椒疫病的研究

1．1 辣椒疫病的主要病症

1．2 辣椒疫霉菌的生物学特性

1．3 辣椒疫病的发生和流行规律

1．4 辣椒疫病的防治

1．5 辣椒疫病的抗性遗传机制

2 辣椒疫病抗性鉴定方法

2．1 灌根接种法

2．2 离体叶片接种法

2．3 伤茎法

2．4 喷雾接种法

2．5 营养液-孢子悬浮液培养法

2．6 疫病毒素接种法

3 遗传连锁图谱的构建

3．1 亲本系选择

3．2 作图群体选择

4 辣椒抗疫病QTL分析

4．1 方差分析法

4．2 区间作图法

4．3 复合区间作图法

4．4 混合线性模型法

4．5 QTL定位研究进展

5 转录组测序(RNA-Seq)技术

5．1 测序技术的发展

5．2 RNA-Seq技术的优势

6 辣椒疫病今后的研究发展方向

第二章 辣椒抗疫病鉴定

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验仪器

1．3 试验方法

2 结果与分析

2．1 辣椒疫霉菌及游动孢于培养

2．2 辣椒感病症状

2．3 F2群体抗疫病鉴定结果

3 讨论

第三章 辣椒分子连锁图谱的构建及抗疫病QTL定位

1 材料和方法

1．1 试验材料

1．2 试验仪器

1．3 主要试剂

1．4 试验方法

2 结果与分析

2．1 基因组DNA的提取

2．2 SSR引物在高抗材料与高感材料亲本基因组DNA多态性扩增

2．3 SSR引物在F2群体上DNA多态性扩增

2．4 构建连锁图谱及QTL分析

3 讨论

3．1 辣椒抗性遗传规律

3．2 辣椒遗传图谱及抗疫病QTL分析

第四章 辣椒疫病抗性基因挖掘

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 信息分析

2 结果与分析

2．1 总RNA提取

2．2 测序结果统计

2．3 组装结果统计

2．4 对Unigene进行SSR分析

2．5 基因功能注释

2．6 Unigene部分序列分析

3 讨论

参考文献

全文结论

创新之处

论文发表

致谢