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东北雨蛙(Hyla japonica)皮肤中新型镇痛肽的发现及其功能研究

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摘要

缩略词及对照表

第一章 文献综述

第一节 引言

1.1 两栖类的生物学特性

1.2 东北雨蛙(Hyla japonica)

1.3 两栖类作为传统中药

1.4 东北雨蛙作为传统中药的药物作用

1.5 两栖类皮肤中镇痛活性物研究现状

第二节 疼痛研究概况

2.1 疼痛

2.2 疼痛的分类

2.3 急性疼痛及其发生机制

2.4 炎症性疼痛及其发生机制

2.5 临床上的镇痛药物概况

第二章 东北雨蛙皮肤cDNA文库的构建及多肽analgesin-HJs的基因克隆

一、材料与方法

1.1 试验材料

1.2 东北雨蛙皮肤cDNA文库的构建

1.3 东北雨蛙皮肤镇痛肽analgesin-HJ及analgesin-HJ(15T)的基因克隆

二、结果与分析

2.1 东北雨蛙皮肤总RNA琼脂糖电泳

2.2 东北雨蛙皮肤cDNA双链琼脂糖电泳

2.3 cDNA文库构建结果

2.4 测序结果分析

三、结果讨论

第三章 多肽analgesin-HJs的镇痛活性检测

一、实验材料

1.1 Analgesin-HJs的合成

1.2 实验动物

二、多肽analgesin-HJs的小鼠镇痛动物模型

2.1 小鼠醋酸扭体试验(Acetic acid-induced writhing test)

2.2 小鼠福尔马林验(Formalin-induced paw licking)

2.3 小鼠热板试验(Hot plate test)

2.4 小鼠摆尾试验(Tail-flick test)

三、多肽analgesin-HJs镇痛活性检测结果分析

3.1 小鼠醋酸扭体试验结果

3.2 小鼠福尔马林试验结果

3.3 小鼠热板试验结果

3.4 小鼠摆尾试验结果

四、结果讨论

第四章 多肽analgesin-HJ的抗炎症活性检测

一、实验材料

1.1 Analgesin-HJ的合成

1.2 实验动物

1.3 细胞及主要试剂

二、角叉菜胶诱导的小鼠足掌肿胀试验(Carrageenan-induced paw edema)

三、Analgesin-HJ对LPS诱导小鼠巨噬细胞Raw 264.7产生细胞因子的影响

3.1 MTT法检测analgesin-HJ对小鼠单核巨噬细胞系Raw 264.7细胞活力的影响

3.2 细胞培养

四、实验结果分析

4.1 Analgesin-HJ对角叉菜胶诱导的小鼠足掌肿胀反应的影响

4.2 MTT法检测analgesin-HJ对小鼠巨噬细胞系Raw 264.7细胞活力的影响

4.3 Analgesin-HJ对LPS诱导的小鼠巨噬细胞Raw 264.7产生细胞因子的影响

第五章 体外检测analgesin-HJ的阿片受体激动剂活性

一、实验材料与方法

1.1 细胞

1.2 主要试剂

1.3 Ca2+动员法检测analgesin-HJ的阿片受体激动剂活性

1.4 细胞培养

1.5 数据分析

二、实验结果

三、结果讨论

论文总结

参考文献

创新之处

攻读学位期间发表论文

获奖情况

致谢

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摘要

两栖类的皮肤中含有种类繁多、功效复杂的生物活性物质,这些活性物质可用于抵御环境中有害因子的侵犯。两栖类的主要栖息方式有四种:水栖、半陆栖、陆栖和树栖,而大多数雨蛙属两栖类是营树栖生活,且它们一般栖息于水边的植物丛及林木上。在这样的生活环境中它们时刻都可能遭遇更多源于生物及非生物因素的伤害,如:天敌、虫类叮咬、微生物感染及刺伤等等,皮肤作为两栖类生命的第一道防线,在适应生存中固然起着非常重要的作用。雨蛙属绿色或棕色的皮肤不仅使它们更能适应丛林生活,而且皮肤中的一些化学组分对它们的生存也起着至关重要的作用。在本研究中,我们首次从东北雨蛙皮肤中发现了两种新型镇痛多肽,并命名为analgesin-HJ和analgesin-HJ(I5T),它们分别是由5个氨基酸FPVI-NH2和FWPVT-NH2组成的小肽,且分子量分别为659.84 Da和647.78 Da。analgesin-HJs是由171个氨基酸组成的前体肽序列编码的,其中含有9个重复的analgesin-HJ拷贝和一个analgesin-HJ(I5T)拷贝。然后,我们对analgesin-HJs可能具有的镇痛及抗炎症活性进行了研究,我们通过四种重要的镇痛动物模型对analgesin-HJs的镇痛作用进行研究检测,这四种镇痛动物模型包括小鼠醋酸扭体实验、小鼠福尔马林实验、小鼠光辐射热摆尾实验及热板实验,结果发现analgesin-HJs具有与阳性对照组吗啡相当的镇痛活性。多肽nalgesin-HJ在角叉菜胶诱导的小鼠足趾肿胀模型中的作用同样验证了analgesin-HJ抗炎止痛的效果。除此之外,通过用LPS刺激诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7产生前炎症因子的实验中,我们发现analgesin-HJ具有抑制小鼠巨噬细胞中前炎症因子释放的作用。在对analgesin-HJ镇痛机制的初步研究中,我们发现analgesin-HJ没有明显的阿片受体激动剂活性,其镇痛作用机制还有待进一步深入研究。analgesin-HJs易于合成、运输及储存,加上它们较强的镇痛效果,analgesin-HJs可能为未来开发新型止痛剂提供研究基础。

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