高脂日粮诱导团头鲂脂肪肝发生机制及黄连素调控的研究

摘要

近年来水产养殖业迅猛发展，集约化养殖，高密度养殖，饲料营养不均衡，过饱食投喂等原因，往往导致鱼类脂肪代谢的障碍与紊乱。而脂肪肝是目前水产养殖业比较容易出现的问题，病鱼生长速度缓慢、饵料系数变大、抗病能力降低、高温季节还会大量死亡等。因此，探讨鱼类脂肪肝发生机制，寻找缓解或预防脂肪代谢障碍的方法对鱼类养殖具有重要生产意义。本试验通过高脂诱导团头鲂脂肪肝，探讨比较正常和脂肪肝病变团头鲂的脂肪代谢途径的差异，对团头鲂肝脏脂肪过度沉积机制做了初步的研究，并用营养学方法干预脂肪肝的发生。试验内容分为六部分:
　　1.高脂诱导团头鲂营养性脂肪肝模型的建立
　　本试验通过投喂3种不同脂肪水平（5％、10％和15％）饲料诱导团头鲂肝脏细胞脂肪变性，以建立团头鲂营养性脂肪肝实验模型，用4种不同饲料在室内循环系统养殖15g左右的团头鲂6周，并于养殖试验的第3、4、5和6周采样，进行肝脏病理组织学观察和血清学测定。结果表明经过6周养殖试验脂肪水平为15％的饲料能诱导团头鲂产生较为严重的脂肪肝病症，光镜下可以发现肝脏组织空泡化严重，电镜观察发现肝脏细胞中有大量的脂滴出现、细胞器结构发生改变;同时血液AST、ALT含量显著升高，提示肝脏受到损伤;血脂含量也显著升高。本试验表明通过投喂团头鲂高脂日粮(15％)能够使其产生营养性脂肪肝，该模型具备脂肪肝的病理特征。
　　2.高脂日粮对团头鲂免疫、氧化应激及肝细胞凋亡的影响
　　本试验旨在探讨高脂日粮对团头鲂非特异性免疫、肝功能及肝细胞凋亡的影响;试验用5％（对照组）与15％（高脂组）脂肪水平的日粮分别投喂团头鲂8周后，测定生长性能、非特异性免疫、氧化应激及肝细胞凋亡指标。结果表明团头鲂摄食高脂日粮8周之后，肝脏脂肪堆积严重，增重率显著降低，血浆溶菌酶、补体活性及球蛋白等非特异性免疫活性降低，肝脏脂质过氧化严重;用细胞凋亡原位检测方法测定肝细胞凋亡情况，结果显示肝细胞凋亡显著增多，且凋亡细胞集中于中央静脉及空泡化严重部位;用RT-PCR方法检测了肝细胞线粒体呼吸链复合物基因表达，结果显示复合物Ⅰ与Ⅲ基因表达量显著低于对照组，另外线粒体琥珀酸脱氢酶及钠钾ATP酶活性均显著低于对照组，这表明线粒体的功能失调，透射电镜也表明线粒体的超微结构受损。总之，本试验表明团头鲂肝脏脂肪过度沉积后，肝脏容易遭受氧化损伤、肝细胞凋亡增加，而这可能与线粒体的功能失调与结构损伤有关;此外，还会导致团头鲂非特异性免疫下降。
　　3.高脂日粮对团头鲂肝脏脂肪分泌、脂肪转运及脂肪沉积的影响
　　本试验旨在探讨团头鲂肝脏脂肪过度沉积的生理机制，为防止养殖鱼类的脂肪肝病变提供参考。用脂肪水平为5％和15％的日粮分别投喂团头鲂8周后采样，进行生理学及生物化学分析。采用腹腔注射Poloxamer407法测定肝脏向外输出脂肪能力，分析脂蛋白组分变化以考察脂肪转运，并考查了脂蛋白酯酶活性及基因表达。结果表明，团头鲂摄食高脂日粮后肝脏超微结构发生显著变化，肝脏细胞内沉积大量脂滴，内质网及线粒体等细胞器超微结构发生改变。高脂组，肝脏分泌甘油三酯能力与血浆中极低密度脂蛋白含量显著降低;同时脂蛋白组分与正常组比较显著不同;肝脏、腹脂及肌肉中多不饱和脂肪含量显著升高，而饱和及单不饱与脂肪酸含量显著降低;各组织脂蛋白酯酶活性及mRNA表达显著升高，肝脏PPARα mRNA表达显著降低，而PPARγ mRNA表达显著升高。本试验结果表明团头鲂摄食高脂日粮后，肝脏向外分泌脂肪能力的下降、脂肪转运系统的改变以及肝脏摄取脂肪能力的增强是造成团头鲂肝脏脂肪过度沉积的主要原因。
　　4.高脂日粮对团头鲂肝脏脂肪酸β-氧化的影响
　　试验用脂肪水平为5％和15％的日粮分别投喂团头鲂8周后采样，进行生理学及生物化学分析。考查肝脏脂肪酸β-氧化能力及限速酶调控的变化。结果显示:团头鲂摄食高脂日粮后，肝脏超微结构发生显著变化，肝脏细胞内沉积大量脂滴，线粒体等细胞器超微结构发生改变;肝脏脂肪酸β-氧化能力显著降低;同时ACO及CPTⅠ两个关键酶活性显著下降;除此之外，CPTⅠ对底物的亲和力及催化效率显著降低;ACO及CPTⅠ基因表达量显著降低;线粒体膜脂肪酸组成，两组间存在显著差异，且高脂组线粒体代谢能力减弱。本试验结果表明:团头鲂摄食高脂日粮后，肝脏脂肪酸β-氧化能力下降，而ACO及CPTⅠ活性剂催化效率的降低是其下降的主要原因，而其基因表达及构象的变化是β-氧化能力下降的最终原因。
　　5.团头鲂CPTⅠ基因cDNA克隆及表达特征分析
　　试验采用RACE技术克隆了团头鲂肉碱酰基转移酶Ⅰ(CPTⅠ)基因全长的cDNA序列，并研究了不同组织中的CPTⅠmRNA表达量及饥饿对肝脏、心脏和肌肉CPTⅠ与PPARs mRNA表达的影响。克隆得到的团头鲂CPTⅠ基因的cDNA序列全长为2499 bp，含有1个长度为2181 bp的开放阅读框，编码726个氨基酸。经预测，其分子量为82950.8，等电点为8.99，并且有3段跨膜区域。序列分析表明，团头鲂CPTⅠ基因包含一个CPTⅠ特有的保守结构域。此外，用RT-PCR技术检测了心脏、肌肉、肝脏等10个组织中CPTⅠ基因表达情况，结果显示表达量最高的两个组织为心脏和肌肉，次之为肠、肝脏与脑，脾、眼与鳃表达量最低。此外，饥饿显著影响团头鲂肌肉、肝脏与心脏CPTⅠ与PPARα的表达，CPTⅠ表达量呈现下降后升高的趋势，团头鲂摄食后CPTⅠ表达量略有下降，但在12-24h CPTⅠ表达量显著的增加，而在72h时表达量又显著的降低。PPARα呈现先升高有下降到的趋势，2-12h阶段表达量一直呈升高趋势，12-72h阶段呈显著降低的趋势。而PPARβ与PPARγ的表达量变化不大。
　　6.黄连素对摄食高脂日粮团头鲂脂肪代谢的影响
　　试验用5％脂肪、15％脂肪及15％脂肪分别添加50与100 mg/kg黄连素投喂团头鲂8周，考查团头鲂肝脏脂肪沉积状况，脂肪代谢相关基因的表达及肝细胞凋亡等指标。结果表明黄连素可以缓解团头鲂肝脏的氧化损伤，降低肝细胞的凋亡率;对线粒体呼吸链复合物活性进行分析时发现，黄连素可以提高复合物Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的活性，透射电镜结果表明黄连素可以减少脂肪在肝脏中的沉积、改善内质网和线粒体的超微结构;用RT-PCR检测了与脂肪代谢的基因表达，结果表明黄连素可以上调脂肪酸分解及脂蛋白分泌相关的基因，而下调脂肪酸吸收及合成相关的基因。总之，黄连素该可以改善摄食高脂日粮团头鲂肝脏的脂肪代谢，减少肝脏脂肪沉积，主要是通过控制脂肪来源与加快脂肪消耗来实现的。

目录

声明

摘要

常用缩略语

前言

第一章 鱼类脂肪代谢的研究进展

1 脂类的生理功能

1．1 脂类的概念

1．2 储能与供能作用

1．3 提供必需脂肪酸

1．4 提供磷脂

1．5 促进脂溶性维生素的吸收

1．6 某些激素和维生素合成的前体

2 脂肪的消化和吸收

3 脂肪的合成

4 脂肪的分解

4．1 线粒体β-氧化

4．2 过氧化物酶体β-氧化

5 脂肪转运

5．1 鱼类脂蛋白的特征

5．2 肝脏VLDL的合成与组装

5．3 影响肝脏VLDL的合成与分泌的因素

5．4 脂肪酸的跨膜与胞内运输

6 脂质代谢的主要调控因子

6．1 PPARs对脂质代谢的调控

6．2 LXR对脂质代谢的调控

6．3 SREBPs对脂质代谢的调控

6．4 MicroRNA对脂质代谢的调控

参考文献

第二章 鱼类脂肪肝的研究进展

1 鱼类脂肪肝的症状及诱发因素

2 鱼类肝脏脂肪沉积机制及调控

3 鱼类脂肪肝产生的营养因素

3．1 脂肪

3．2 蛋白质

3．3 碳水化合物(糖类)

4 鱼类抗脂肪肝因子的研究

4．1 胆碱、蛋氨酸和甜菜碱

4．2 肉碱

4．3 磷脂

4．4 黄连素

4．5 其他

参考文献

第三章 高脂诱导团头鲂营养性脂肪肝模型的建立

1 材料与方法

1．1 试验设计与饲料配方

1．2 试验鱼与养殖管理

1．3 样品采集

1．4 样品分析

1．5 数据统计与分析

2 试验结果

2．1 生产性能及各组织脂肪含量

2．2 血液生化指标

2．3 肝脏组织学分析

3 讨论

4 结论

参考文献

第四章 高脂日粮对团头鲂免疫、氧化应激及肝细胞凋亡的影响

1 材料与方法

1．1 试验设计与饲料配方

1．2 试验鱼与养殖管理

1．3 样品采集

1．4 样品测定

1．5 数据统计与分析

2 试验结果

2．1 生产性能及各组织脂肪含量

2．2 肝脏组织学观察

2．3 线粒体代谢状态

2．4 肝脏氧化应激状态

2．5 非特异性免疫指标

3 讨论

4 结论

参考文献

第五章 高脂日粮对团头鲂肝脏脂肪分泌、脂肪转运及脂肪沉积的影响

1 材料与方法

1．1 试验设计及饲料配方

1．2 试验鱼与养殖管理

1．3 样品采集

1．4 样品采集

1．5 数据统计与分析

2 试验结果

2．1 肝脏甘油三酯、胆固醇及肌肉脂肪含量

2．2 肝脏分泌甘油三酯的速率

2．3 脂蛋白总量及组分分析

2．4 肝细胞内质网超微机构

2．5 肝脏、肌肉、腹脂及血浆VLDL脂肪酸组成

2．6 肝脏、肌肉及腹脂LPL活性及mRNA表达量

2．7 肝脏过氧化物酶体增殖因子(PPARs)mRNA表达量

3 讨论

4 结论

参考文献

第六章 高脂日粮对团头鲂肝脏脂肪酸β-氧化的影响

1 材料与方法

1．1 试验设计及饲料配方

1．2 试验鱼与养殖管理

1．3 样品采集

1．4 样品测定

1．5 数据统计与分析

2 试验结果

2．1 肝细胞超微结构

2．2 肝脏脂肪酸β-氧化速率

2．3 肝脏CPTI酶动力学特征

2．4 肝细胞线粒体状态

2．5 肝脏脂肪代谢相关基因表达

3 讨论

4 结论

参考文献

第七章 团头鲂CPTI基因cDNA克隆及表达特征分析

1 材料与方法

1．1 试验鱼与试验设计

1．2 样品采集

1．3 CPTI基因cDNA片段的克隆与测序

1．4 数据统计与分析

2 试验结果

2．1 团头鲂CPTI基因cDNA全长克隆及序列分析

2．2 团头鲂CPTI同源性分析

2．3 团头鲂CPTI组织表达分析

2．4 饥饿对团头鲂CPTI及PPARs表达的影响

3 讨论

4 结论

参考文献

第八章 黄连素对摄食高脂日粮团头鲂脂肪代谢的影响

1 材料与方法

1．1 试验设计及饲料配方

1．2 试验鱼与养殖管理

1．3 样品采集

1．4 样品分析

1．5 数据统计与分析

2 试验结果

2．1 生产性能及形体指标

2．2 血液生化指标

2．3 肝脏氧化应激状态

2．4 线粒体呼吸链复合体酶活性

2．5 肝脏组织学观察

2．6 肝脏脂肪代谢相关基因表达

3 讨论

4 结论

参考文献

全文结论

创新点

本研究的不足与展望

附录

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文