绿盲蝽对毒死蜱的抗性机理研究

摘要

自1997年以来，随着转Bt基因棉花的大面积推广种植，我国棉田害虫的治理方式发生了一系列变化，棉田害虫种群也随之发生演替。盲蝽逐渐从棉田次要害虫上升成为主要害虫并波及到多种重要作物、蔬菜及果树，其中绿盲蝽为盲蝽种群的优势种之一，在我国分布最广、为害最重。近年来，在我国各地随着盲蝽为害程度的不断加重，防治盲蝽的力度也持续加强，而化学防治的速效高效性使之成为盲蝽综合防治体系中过度依赖的植保技术，毒死蜱等有机磷杀虫剂成为棉田盲蝽化学防治的常规药剂。杀虫剂的过度及不合理使用将导致盲蝽对其敏感性降低，抗药性问题不可避免。
　　我国对于盲蝽的抗性监测及抗性机制研究尚处于起步阶段，报道较少且缺乏系统性的研究。本文在室内筛选并获得抗性品系的基础上，系统研究了绿盲蝽对毒死蜱的抗性机制。通过代谢酶活性测定、活体增效试验排除了酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶、多功能氧化酶与绿盲蝽毒死蜱抗性的关系;通过AChE动力学参数测定、ace1基因克隆、基因表达水平定量和基因突变频率检测明确了靶标AChE敏感性下降与绿盲蝽毒死蜱抗性密切相关，并首次发现绿盲蝽ace1基因A216S突变是BZ-R品系对毒死蜱产生高水平抗性的主要机理。本文的研究结果阐明了绿盲蝽对毒死蜱的抗性机制，为建立绿盲蝽对毒死蜱抗性的分子检测技术及制定相应的抗性治理对策提供了重要理论依据。
　　1.绿盲蝽毒死蜱抗性品系的筛选
　　采用浸液法对2009年7月采自山东省滨州市无棣县的绿盲蝽种群(BZ)进行了23代的室内筛选，并最终获得绿盲蝽毒死蜱抗性品系(BZ-R)，毒死蜱对其致死中浓度为75.35 mg·L-1。BZ-R品系对毒死蜱的抗性是BZ品系的10倍，是敏感品系(SLF)的59.8倍，达到高抗水平。
　　2.解毒代谢酶与绿盲蝽对毒死蜱抗性的关系
　　测定了绿盲蝽品系(BZ-R、BZ、SLF)酯酶(EST)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)及多功能氧化酶(MFO)的活性并进行了活体增效实验。结果显示，BZ-R品系EST、GST和MFO的活力分别是SLF敏感品系的1.7、1.6和0.8倍，但两品系代谢酶活性间的差异未达到显著水平;在BZ-R品系中，DEF、DEM和PBO对毒死蜱的增效作用分别为0.7、1.2和1.1倍，增效作用不明显。上述结果表明，EST、GST和MFO的解毒代谢活性与BZ-R品系对毒死蜱的抗性不相关。
　　3.乙酰胆碱酯酶与绿盲蝽对毒死蜱抗性的关系
　　测定了BZ-R、BZ和SLF品系乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性及动力学参数。结果显示，BZ-R品系的AChE活力显著降低，低于SLF品系的1/2; BZ-R抗性品系AChE动力学参数也发生了显著改变，其Km值为SLF品系的3倍，Vmax值为SLF品系的1/3，说明在BZ-R品系中，AChE与底物的亲和力降低、反应速度下降。上述结果表明BZ-R品系中的AChE在质上可能发生了改变，此改变与绿盲蝽对毒死蜱的抗性相关。
　　为了明确靶标突变在毒死蜱抗性中的作用，克隆了绿盲蝽的ace1全长基因。ace1基因开放阅读框长为1791bp，编码596个氨基酸，具有乙酰胆碱酯酶家族所有的特征结构，如催化三联体、氧阴离子洞及氯离子结合位点等。绿盲蝽ace1基因与已克隆的黑肩绿盲蝽（Cyrtorhinus lividipennis）ace1基因的相似性达到90％。
　　对BZ-R、BZ、SLF品系中ace1基因mRNA表达量进行了检测，结果显示3个品系ace1基因的相对表达量分别为1.17，1.95，1.0，彼此间无显著差异，表明ace1基因的表达量与绿盲蝽对毒死蜱的抗性无关。对3个品系AChE氨基酸序列进行比对后发现，绿盲蝽ace1基因中存在A216S突变，该突变位于AChE重要的氧阴离子洞上，且靠近催化三联体之一的Ser，是由于ace1基因第646位上碱基G突变为T所致;利用PCR产物直接测序法检测到在SLF、BZ、BZ-R品系中ace1基因A216S的突变频率分别为0.21、0.34和1.0，突变频率随绿盲蝽对毒死蜱抗性水平的升高而升高。上述结果表明，绿盲蝽ace1基因A216S突变可能导致AChE高级构象发生改变，从而降低了对毒死蜱的敏感性，并最终导致BZ-R品系对毒死蜱产生了高水平抗性。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 昆虫对有机磷杀虫剂的抗药性机理

1．1 代谢抗性

1．2 靶标抗性

2 盲蝽对有机磷杀虫剂的抗性研究概况

2．1 言蝽对有机磷的代谢抗性

2．2 盲蝽对有机磷的靶标抗性

3 有机磷杀虫剂—毒死蜱

3．1 毒死蜱的基本特点

3．2 昆虫对毒死蜱的抗性研究进展

4 目的与意义

第二章 材料与方法

1 供试昆虫

2 主要试剂

2．1 供试药剂

2．2 生化试剂

2．3 分子试剂

2．4 主要仪器设备

3 试验方法

3．1 生物测定方法

3．2 抗性品系的筛选

3．3 增效剂试验

3．4 解毒代谢酶活性测定

3．5 乙酰胆碱酯酶活性的测定及动力学参数的测定

3．6 绿盲蝽ace1基因全长的克隆

4 数据分析

4．1 生物测定结果数据分析

4．2 酶活性测定结果数据分析

第三章 结果与分析

1 绿盲蝽抗性品系的筛选

2 绿盲蝽对毒死蜱的代谢抗性机理

2．1 绿盲蝽不同品系解毒代谢酶活性测定

2．2 增效剂在绿盲蝽不同品系中对毒死蜱的增效作用

3 绿盲蝽对毒死蜱的靶标抗性机理

3．1 不同品系AChE活性及AChE动力学参数

3．2 绿盲蝽ace1基因全长的克隆及序列分析

3．3 绿盲蝽ace1基因A216S突变与毒死蜱抗性的关系

3．4 各品系间ace1基因相对表达量的比较

第四章 讨论

1 绿盲蝽毒死蜱抗性品系的代谢抗性机理

1．1 解毒代谢酶活性与绿盲蝽毒死蜱抗性的关系

1．2 增效剂对毒死蜱的增效作用

2 绿盲蝽毒死蜱抗性品系的靶标抗性机理

2．1 AChE活性变化与绿盲蝽毒死蜱抗性的关系

2．2 Ace基因突变与绿盲蝽毒死蜱抗性的关系

3 建立绿盲蝽有机磷抗性的分子检测技术

全文总结

参考文献

致谢