稻飞虱与黑肩绿盲蝽乙酰胆碱酯酶和RDL的差异及毒理学特性研究

摘要

褐飞虱Nilaparvata luges St(a)l（Brown planthopper, BPH）是目前最主要的水稻害虫之一。化学防治是其目前最为常见的防治手段。但长期的化学防治不仅危害了生态环境，更导致了褐飞虱对多种化学杀虫剂产生了极强的抗性。因此，摒弃单一的化学防治，采用化学防治与生物防治相结合的综合治理措施显得尤为必要。
　　黑肩绿盲蝽Cyrtorrhlnus lividlpennis Bedt作为褐飞虱最重要的天敌之一，其对褐飞虱低龄若虫及卵的数量控制效果明显。但是由于生存环境与稻田飞虱相似，黑肩绿盲蝽种群在褐飞虱的化学防治的同时也遭到了破坏。因此，开发一种既对褐飞虱有显著效果，又对其天敌黑肩绿盲蝽危害较小的化学杀虫剂是一种全新的思路。本文首先对这两种昆虫进行了6种杀虫剂的敏感性差异评价，再从分子水平上，先后通过现代分子生物学实验和测序技术，对黑肩绿盲蝽的靶标分子进行相关研究。主要研究结果如下:
　　一、黑肩绿盲蝽与褐飞虱对6种杀虫剂的毒力测定与敏感性差异
　　利用药膜法对2013年采自我国广西南宁地区同一片稻田的黑肩绿盲蝽与褐飞虱的三龄若虫进行了杀虫剂敏感性测定。结果显示，测试的6种杀虫剂中，除了醚菊酯之外，黑肩绿盲蝽相较于对其余5种杀虫剂（氟虫腈，仲丁威，甲萘威，对氧磷，二嗪氧磷）均表现出显著的敏感性。其中黑肩绿盲蝽对仲丁威，甲萘威，对氧磷，二嗪氧磷的敏感性分别为褐飞虱的5.05倍，5.44倍，3.67倍，2.84倍。黑肩绿盲蝽对于氟虫腈的敏感性达到了褐飞虱的12.81倍，表现出很强的敏感性。
　　二、稻飞虱与黑肩绿盲蝽乙酰胆碱酯酶基因差异分析
　　通过高通量测序技术，获得的转录组数据库，通过检索转录组数据库中的基因序列和手工拼接，获得两条可能编码乙酰胆碱酯酶的基因序列。在这两个已有基因片段的基础上设计出特异引物，采用巢式PCR和RACE技术，克隆了基因全长，并进行相关分析。根据相似性将两个乙酰胆碱酯酶基因分别命名为黑肩绿盲蝽的AChE1基因Cl-ace1和AChE2基因Cl-ace2。同源性分析发现，这两个基因与包括稻飞虱在内的昆虫乙酰胆碱酯酶两个基因有很高相似性。
　　三、黑肩绿盲蝽RDL亚基的克隆与比对分析
　　在转录组数据库的基础上，通过人工查找和基因比对，查找到数据库中多条与昆虫RDL基因相似的序列。经过转录组数据库的搜索比对中发现了黑肩绿盲蝽RDL基因的两种不同转录本，主要差异为M3和M4两个跨膜区之间的胞内区之间有一段长度为31aa的氨基酸序列的插入。在此基础上利用RACE技术进行基因克隆，获得了黑肩绿盲蝽这两种RDL基因全长。经过分析后分别将其命名为Cl-RDL和Cl-RDL-In。
　　四、稻飞虱与黑肩绿盲蝽RDL对氟虫腈敏感性的差异
　　通过体外表达和双电极电压钳记录技术，记录了黑肩绿盲蝽两种RDL亚基与褐飞虱RDL亚基对GABA和氟虫腈的敏感性差异。结果表明，黑肩绿盲蝽Cl-RDL,Cl-RDL-In比褐飞虱Nl-RDL对GABA和氟虫腈更加敏感，Cl-RDL-In相较于Cl-RDL对氟虫腈有一定程度上的敏感性下降，但黑肩绿盲蝽两个RDL之间对GABA的敏感性没有显著差异。在随后洗脱了氟虫腈之后的电流监测中发现，黑肩绿盲蝽Cl-RDL-In的电流反应出现了明显的恢复，而对Cl-RDL的检测中没有发现这种现象。这可能预示着，黑肩绿盲蝽RDL亚基中的插入片段对RDL亚基的生理功能上有特殊的作用，可能与氟虫腈的耐受性相关。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．褐飞虱的防治与抗药性

2．昆虫抗药性机理及其研究进展

2．1 昆虫抗药性机理

2．2 两个重要的杀虫剂靶标

3．褐飞虱的生物防治

3．1 寄生性天敌

3．2 捕食性天敌

4．转录组学和测序技术的发展

4．1 转录组与转录组学

4．2 转录组研究进展

4．3 高通量测序技术的发展与应用

5．本研究的目的及意义

第二章 黑肩绿盲蝽与褐飞虱对6种杀虫剂的毒力测定与敏感性差异

1 材料与方法

1．1 供试虫源

1．2 试虫饲养

1．3 供试药剂

1．4 生物测定方法

1．5 结果检查与数据处理

2 结果与分析

3 讨论

第三章 稻飞虱与黑肩绿盲蝽乙酰胆碱酯酶基因差异分析

1 材料与方法

1．1 供试虫源

1．2 主要试剂

1．3 总RNA提取及cDNA模板合成

1．4 PCR引物设计

1．5 黑肩绿盲蝽乙酰胆碱酯酶基因的克隆

2 结果与分析

2．1 基于转录组数据库的黑肩绿盲蝽乙酰胆碱酯酶基因序列分析

2．2 黑肩绿盲蝽乙酰胆碱酯酶基因全长克隆与序列分析

2．3 黑肩绿盲蝽与稻飞虱乙酰胆碱酯酶基因序列比对

3 讨论

第四章 黑肩绿盲蝽RDL亚基的克隆与比对分析

1 材料与方法

1．1 供试虫源

1．2 主要试剂

1．3 总RNA提取及cDNA模板合成

1．4 PCR引物设计

1．5 黑肩绿盲蝽RDL亚基基因的克隆

2 结果与分析

2．1 基于转录组数据库的黑肩绿盲蝽GABA受体基因序列分析

2．2 黑肩绿盲蝽RDL亚基基因全长的克隆

2．3 黑肩绿盲蝽与稻飞虱RDL亚基基因序列比对

3 讨论

第五章 稻飞虱与黑肩绿盲蝽RDL对氟虫腈敏感性差异

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 供试化合物

1．3 载体构建

1．4 异源表达与电生理实验

2 结果与分析

2．1 两种昆虫RDL对GABA和氟虫腈的敏感性差异

2．2 氟虫腈对两种昆虫RDL的抑制作用

3 讨论

全文总结

参考文献

攻读学位期间发表的论文

攻读学位期间获得的奖励

致谢