产甲烷菌抑制剂对单胃动物后肠微生物代谢的影响

摘要

近年来，越来越多的报道将人们注意力集中到单胃动物后肠甲烷气体主要生产者一产甲烷菌，产甲烷菌利用饲料中营养物质代谢并最终生成甲烷气体排出体外，其产生过程一定程度影响宿主的能量代谢。本论文主要关注了抑制单胃动物后肠产甲烷菌对后肠菌群代谢的影响。首先设计了体外发酵模型来监测抑制接种粪样中产甲烷菌后对发酵过程中产气、产挥发性脂肪酸（Volatile fatty acid，VFA）的影响。随后，以三元杂交仔猪为模型动物，通过口腔灌注产甲烷菌抑制剂溴氯甲烷（Bromochloromethane，BCM），观察了后肠产甲烷菌被抑制后，菌群结构及挥发性脂肪酸浓度的变化。最后，以小鼠为动物模型，通过饮水添加BCM，研究甲烷菌抑制剂和高脂日粮对小鼠生长、盲肠菌群结构、VFA浓度、血清指标以及肝脏脂肪代谢相关基因的表达的影响。
　　1.甲烷菌抑制剂对猪粪样微生物体外发酵不同底物的影响
　　研究发现，猪后肠中也存在产甲烷菌，然而目前我们对其在猪后肠中的作用了解还不多。本试验利用体外发酵技术，通过用甲烷菌抑制剂抑制产甲烷菌研究其对猪粪中微生物发酵不同底物的影响。采集断奶仔猪新鲜粪样作为接种菌来源，以果寡糖（Fructooligosaccharide，FOS）、苜蓿、果胶、小麦麸、小麦淀粉等饲料原料作培养基发酵底物进行体外发酵，记录产气量、甲烷产生量，测定发酵液挥发性脂肪酸浓度。结果表明，发酵36h后有机物校正产气量(Organic matter calibration gas production，OMCV)、产气量到达总量1/2的时间(T1/2)、发酵过程中最快产气速度（Rmax）以及到达最快产气速度的时间（Tmax）均受到底物的极显著影响（P＜0.01）;除OMCV外（P＞0.05），均极显著受抑制剂影响(P＜0.01);并且受到抑制剂与底物互作效应的影响(P＜0.01)。不同底物甲烷产生量高低顺序为:苜蓿组＞麸皮组＞果胶组＞FOS组＞淀粉组。
　　2.灌胃BCM对仔猪粪样微生物区系及挥发性脂肪酸浓度的影响
　　本试验旨在研究产甲烷菌抑制剂BCM对仔猪粪样微生物区系以及粪样VFA浓度的影响。选取18头38日龄（断奶后10天）雌性杜长大三元断奶仔猪，随机分成2个组:口腔灌喂BCM的处理组和灌喂生理盐水的对照组，每组9个重复，每个重复一头仔猪。试验期为40天，每10天记录体重，试验期结束，采集仔猪粪样，提取核酸，使用变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）和real-timePCR研究其菌群结构，气相色谱法分析粪样中挥发性脂肪酸含量。结果表明，BCM处理对仔猪体增重无显著影响;DGGE图谱中不同日龄组，不同处理组样品聚于不同簇，但各组总细菌和产甲烷菌拷贝数无显著差异。BCM处理组仔猪粪样中异丁酸占总挥发酸比例显著降低(P＜0.05); BCM处理显著增加仔猪粪样丙酸比例(P＜0.05)。结果提示，日龄对粪样微生物和挥发性脂肪酸产生的影响较大，而添加BCM的作用效果不明显。
　　3.高脂肪日粮和产甲烷菌抑制剂对C57BL/6J小鼠盲肠微生物及脂肪代谢的影响
　　本试验旨在研究产甲烷菌抑制剂BCM对采食高、低脂肪水平日粮小鼠的肠道微生物以及脂肪代谢的影响。选取32只21日龄的雌性C57BL/6J小鼠，随机分成4组:对照低脂日粮组、对照低脂日粮加BCM组、高脂日粮组及高脂日粮加BCM组，每组8个重复，BCM通过饮水添加。饲养周期为6周，试验期结束，采集小鼠血液样品，用于生化指标分析;采集小鼠盲肠内容物，使用变性梯度凝胶电泳技术及real-timePCR等分子技术研究其菌群结构;气相色谱法分析粪样中挥发性脂肪酸含量;real-timePCR技术分析肝脏中脂肪代谢相关基因表达。高脂日粮和BCM处理对小鼠体增重均无显著影响;DGGE图谱中低脂日粮组和高脂日粮组样品聚于不同簇，但对各组总细菌、产甲烷菌和硫还原菌数量无显著影响。高脂日粮组粪样中乙酸的比例显著降低（P＜0.05）;BCM处理显著增加小鼠粪样丙酸比例（P＜0.05）;高脂日粮处理显著影响高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇含量（P＜0.05）;高脂日粮处理促进了甘油三酯水解酶表达（P＜0.05）。高脂日粮对小鼠肠道菌群结构以及脂肪代谢有明显影响，而BCM处理影响较小。

目录

声明

摘要

中英文对照表

引言

文献综述

1 单胃动物消化特点

2 肠道氢的来源与代谢途径

3 后肠三种主要氢利用菌的代谢特点

3．1 产甲烷菌

3．2 产乙酸菌

3．3 硫酸盐还原菌

4 三种氢利用菌的代谢关系

5 三种氢利用菌与宿主能量代谢的关系

6 本研究目的和技术路线

参考文献

试验一 甲烷菌抑制剂对猪粪样微生物体外发酵不同底物的影响

1 材料与方法

1．1 试验设计

1．2 厌氧培养基和粪样的准备

1．3 指标的测定

1．4 主要的试剂和仪器

1．5 统计与分析

2 结果与分析

2．1 累积产气量比较

2．2 累积甲烷产量比较

2．3 VFA产量比较

3 讨论

参考文献

试验二 灌胃BCM对仔猪粪样微生物区系及挥发性脂肪酸浓度的影响

1 材料和方法

1．1 试验动物及采样

1．2 粪样DNA提取、PCR扩增及DGGE分析

1．3 总菌和产甲烷菌的real-time PCR定量分析

1．4 粪样挥发性脂肪酸的测定

1．5 数据分析

2 结果与分析

2．1 仔猪的相对体增重

2．2 仔猪粪样微生物菌群DGGE图谱

2．3 总菌与产甲烷菌real-time PCR定量

2．4 粪样挥发性脂肪酸含量测定

3 讨论

参考文献

试验三 高脂肪日粮和产甲烷菌抑制剂对C57BL／6J小鼠盲肠微生物及脂肪代谢的影响

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 盲肠食糜总DNA的提取与PCR-DGGE

1．3 real-time PCR定量菌群

1．4 粪样挥发性脂肪酸的测定

1．5 血清生化指标测定

1．6 肝脏组织RNA提取与基因表达分析

1．7 数据分析

2 结果和分析

2．1 小鼠相对增重

2．2 小鼠盲肠中菌群组成

2．3 小鼠粪样中挥发性脂肪酸组成

2．4 小鼠血清中脂肪代谢相关指标

2．5 小鼠肝脏脂肪代谢相关基因的表达

3 讨论

参考文献

全文结论

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢

附录