苜蓿盲蝽化学感受蛋白AlinCSP7-8免疫定位及气味结合特性

摘要

苜蓿盲蝽隶属半翅目盲蝽科，苜蓿盲蝽属，是一种不完全变态昆虫，植食性害虫，寄主范围十分广泛，可取食多种经济作物，如藜科、豆科、亚麻科等。近些年来，随着Bt棉花的大面积种植，以棉铃虫为主的鳞翅目害虫的种群数量大大减少，而以苜蓿盲蝽为主的盲椿象的危害却越来越严重。近年来从昆虫的化学通讯机制入手，通过调控昆虫与昆虫、昆虫与植物之间的化学通讯，来抑制昆虫种群的繁殖，从而达到控制虫害的目的，成为化学生态学研究的热点。
　　昆虫在长期的进化过程中，嗅觉系统高度特化。昆虫种群的繁荣很大程度上得益于其能够有效的感受外界环境中的信息物质，并能够及时作出有利于自身生存和繁衍的行为反应。昆虫嗅觉识别过程是在系列相关蛋白协同作用下完成的，相关蛋白包括气味结合蛋白、化学感受蛋白、气味受体、神经元膜蛋白和气味降解酶等。其中昆虫化学感受蛋白被认为是昆虫长期以来进化的结果，除了具有结合及运输疏水性的气味分子的功能外，还承担更多其他的生理功能，如调节昆虫生长发育，参与昆虫免疫反应等。本文通过对苜蓿盲蝽化学感受蛋白AlinCSP7-8两个目的基因序列的筛选和鉴定，确定了其全长序列，利用qPCR技术对两个基因在苜蓿盲蝽雌雄成虫不同组织间的表达量进行了分析。克隆、表达和纯化了AlinCSP7-8两个重组蛋白，利用荧光竞争结合实验和免疫组织化学定位技术对其气味结合特性及在触角感器中的分布进行了研究。主要研究结果如下:
　　1、利用qPCR技术对AlinCSP7-8在苜蓿盲蝽雌雄成虫不同组织间的表达情况进行了解析。结果表明，AlinCSP7和AlinCSP8主要在苜蓿盲蝽的触角、足和翅中表达，其他部位虽也有表达，但表达量极少。同时雌虫触角目的基因表达量高于雄虫触角。
　　2、克隆、表达和纯化了重组蛋白AlinCSP7-8，通过荧光竞争结合实验研究了两个目标蛋白与20种候选气味分子的结合特性。AlinCSP7与香茅醇、异樟醇和β-罗勒烯有很强的结合能力;而AlinCSP8与香茅醇、异樟醇和β-蒎烯表现出很强的结合能力。同时AlinCSP7-8也可与盲蝽科性信息素类物质如丁酸反-2-己烯酯、丁酸丁酯和己酸己酯有效结合，推测这两个化学感受蛋白可能在感受性信息素和普通植物挥发物过程中发挥作用。
　　3、通过免疫组织化学定位技术对AlinCSP7-8在不同触角感器中的分布进行定位。结果显示这两个化学感受蛋白主要分布在短锥形感器和长曲刺形感器中，而毛形感器和长直刺形感器中没有分布。推测二者可能与感受普通气味分子相关，同时具有某些味觉功能。
　　总之，AlinCSP7-8在苜蓿盲蝽嗅觉识别过程中发挥作用，可以作为潜在的调控靶标进行干扰苜蓿盲蝽害虫的寄主定位及交配等行为，从而达到控制害虫的目的。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 昆虫触角感器的结构及嗅觉感受机制

1．2 昆虫触角感器的类型和功能

1．3 昆虫化学感受蛋白的研究进展

1．3．1 昆虫化学感受蛋白的结构

1．3．2 昆虫化学感受蛋白的表达分布

1．3．3 昆虫化学感受蛋白的功能研究

1．4 研究思路

1．4．1 立题依据

1．4．2 研究内容

第二章 AlinCSP7-8基因组织表达谱分析

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂

1．3 主要实验设备

1．4 RNA的提取

1．5 第一链cDNA的合成

1．6 引物设计

1．7 qPCR反应

1．8 目的基因和内参基因扩增效率一致性的验证

1．9 数据处理

2 结果与分析

2．1 扩增效率一致性的验证

2．2 苜蓿盲蝽AlinCSP7和AlinCSP8的表达谱结果

3 讨论

第三章 AlinCSP7-8的气味结合特性

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 实验试剂

1．3 AlinCSP7-8的克隆、表达和纯化

1．4 1-NPN蓝移现象的观察

1．5 荧光竞争结合实验

2 结果与分析

2．1 AlinCSP7-8序列分析

2．2 AlinCSP7-8蛋白的克隆、表达和纯化结果与分析

2．3 1-NPN蓝移现象的观察

2．4 AlinCSP7-8的结合特性分析

3 讨论

第四章 苜蓿盲蝽触角AlinCSP7-8的免疫组织定位

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要仪器

1．3 主要试剂

1．4 抗体的制备

1．5 免疫组织化学定位

2 结果与讨论

全文总结

参考文献

致谢