核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)效应调控因子RRG-1和RRG-2的生物学功能研究

摘要

油菜菌核病是一种世界性病害，其病原为核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）。在我国，该病菌寄主范围非常广泛，能侵染包括75科278属400余种植物。目前，油菜菌核病的防治主要以化学防治为主。咯菌腈作为一种新型的苯吡咯类杀菌剂对油菜菌核病具有良好的防效，但该药剂在我国油菜菌核病的防治上尚未进行登记，同时，咯菌腈对核盘菌的作用机制尚不明确。本实验室已有研究表明，咯菌腈对核盘菌的作用机制与核盘菌的双组分信号系统有关，而RRG-1和RRG-2是双组分信号系统中两个重要的效应调控因子。因此，本文首先系统优化了核盘菌原生质体的制备与PEG介导的遗传转化体系;然后，利用该体系分别构建了基因敲除突变体及其回复突变体来研究RRG-1和RRG-2的生物学功能，进一步明确RRG-1和RRG-2对咯菌腈敏感性的调控机制。该研究将对油菜菌核病的综合防控、研发原创性杀菌剂具有重要意义。
　　1.本文系统优化了核盘菌原生质体的制备条件及PEG介导的原生质体遗传转化体系。经优化，确定制备原生质体的最佳条件为:在25℃恒温震荡培养箱中用YEPD液体培养基175 r/min震荡培养出发菌株36 h;先用灭菌纱布过滤，灭菌水冲洗2次，再用缓冲液Ⅲ（0.8 M甘露醇的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液）冲洗2次，转移到含有10mL1.5％酶解液（裂解酶L）的小三角瓶中，30℃85 r/min酶解2.5 h;1200 r/min离心5min收集原生质体，用缓冲液Ⅲ重悬浮，1200 r/min离心5 min; STC重悬浮，1200r/min离心5 min;再用STC重悬浮至原生质体浓度约为108个/μL;取80μL原生质体悬浮液于转化管中，再加入20μL PTC，冰上放置待用。将含有潮霉素磷酸转移酶基因（HPH）的片段转化到核盘菌原生质体后，经100μg/mL潮霉素B筛选转化子。
　　2.双组分信号传导途径参与调控渗透压和氧化胁迫、菌丝生长、致病性和杀菌剂抗性等生物学功能。本文利用上述建立的PEG介导的核盘菌原生质体遗传转化体系，对核盘菌双组分信号传导途径两个效应调控因子SsRRG-1和SsRRG-2进行基因敲除及回复验证，并对其生物学表型进行了分析。结果表明:与亲本菌株相比，SsRRG-1基因敲除突变体对SDS、高糖渗透压、过氧化氢产生的氧化胁迫以及对咯菌腈的敏感性显著增加，菌丝生长速率显著降低，菌丝分支增多;致病力显著下降，细胞膜透性增大，菌核变小且数量增多，SsRRG-1基因敲除突变体胞内甘油含量及对不同金属离子胁迫的敏感性无显著性差异。SsRRG-1基因回复突变体的上述表型与亲本菌株差异不显著。
　　与亲本菌株相比，SsRRG-2基因敲除突变体对咯菌腈的敏感性降低，对高盐渗透压、过氧化氢产生的氧化压、SDS、刚果红和Caffine敏感性增加;草酸及胞内甘油含量减少，菌丝顶端扭曲，致病力显著下降，细胞膜透性增大，不能形成正常的菌核;对不同金属离子胁迫的敏感度也存在一定差异;qRT-PCR结果表明，SsRRG-2基因敲除后，双组分信号系统中的下游关键激酶基因SsOS4、SsOS5表达量增加，SsHog1表达量无显著变化。

目录

声明

摘要

符号及缩略说明表

第一章 综述

1 油菜菌核病及防治研究现状

1．1 核盘菌概况

1．2 核盘菌生活史

1．3 油菜菌核病防治现状

2 丝状真菌效应调控因子RRG-1、RRG-2的研究概况

2．1 丝状真菌效应调控因子RRG-1

2．2 丝状真菌效应调控因子RRG-2

3 苯吡咯类杀菌剂研究概况

4 本研究的目的和意义

参考文献

第二章 核盘菌原生质体制备与遗传转化体系的优化

1 材料与方法

1．1 菌株、质粒、培养基与试剂

1．2 转化片段

1．3 原生质体制备条件的优化

1．4 再生培养条件的优化

1．5 PCR分析验证

2 结果与分析

2．1 原生质体制备条件的优化

2．2 再生培养条件的优化

3 讨论

参考文献

第三章 核盘菌效应调控因子SsRRG-1的生物学功能分析

1 材料和方法

1．1 供试菌株、质粒、杀菌剂与培养基

1．2 供试试剂

1．3 核盘菌效应调控因子SsRRG-1的鉴定及序列分析

1．4 核盘菌SsRRG-1基因敲除载体的构建

1．5 原生质体的制备与遗传转化

1．6 转化子的验证

1．7 敲除突变体的互补验证

1．8 表型分析

1．9 SsRRG-1基因敲除对上下游基因表达的影响

2 结果与分析

2．1 核盘菌SsRRG-1基因的鉴定及序列分析

2．2 载体构建

2．3 转化子验证

2．4 敲除突变体表型分析

2．5 细胞膜透性测定

2．6 胞内甘油含量测定

2．7 细胞壁抑制剂敏感性测定

2．8 致病力测定

2．9 SsRRG-1基因敲除后对其上下游基因表达的影响

3 讨论

参考文献

第四章 核盘菌效应调控因子SsRRG-2的基因功能分析

1 材料和方法

1．1 供试菌株、质粒、杀菌剂与培养基

1．2 供试试剂

1．3 核盘菌RRG-2基因的鉴定及序列分析

1．4 核盘菌RRG-2基因敲除载体的构建

1．5 原生质体的制备与遗传转化

1．6 转化子的验证

1．7 敲除突变体的互补验证

1．8 表型分析

1．9 SsRRG-2基因敲除对上下游基因表达的影响

2 结果与分析

2．1 核盘菌SsRRG-2基因的鉴定及序列分析

2．2 核盘菌SsRRG-2基因敲除载体的构建

2．3 转化于验证

2．4 敲除突变体表型分析

2．5 细胞膜透性测定

2．6 胞内甘油含量测定

2．7 细胞膜、细胞壁抑制剂敏感性测定

2．8 致病力

2．9 SsRRG-2基因敲除后对其上下游基因表达的影响

3 讨论

参考文献

全文小结

攻读硕士学位期间发表的学术论文及专利学术论文

致谢