水稻土微生物群落结构及功能随植稻年限的变化：滩涂围垦稻田时间序列的案例研究

摘要

土壤有机质是土壤的最关键组分，它促使土壤团聚体和良好结构的形成，提供微生物能源而养育土壤的生物区系，是土壤生物过程的驱动者，从而驱动和调节土壤中养分、水、能量循环，发挥土壤的生态系统功能服务。因此，土壤发育中土壤有机质-团聚体-微生物区系-土壤生态系统功能活性间的关系是土壤学的本质问题。已有研究表明，水稻土在水耕熟化过程中有机碳有明显的积累趋势和固碳潜力。
　　水稻土是我国长期栽培水稻下水耕熟化过程而形成发育的一类特色农业土壤，是独特的人为土壤(Anthrosols)。我国种植水稻已有7000-10，000年的历史，水稻土可以起源于多种土壤类型，经过长期水稻生产的人为管理和耕作，水耕熟化过程的长期演化而定向发育为具有特有的剖面形态特征和理化性质，并形成稳定的作物生产力。已有研究表明，水稻种植下水稻土有机碳积累明显，并具有较高的化学和生物学稳定性。水稻土发育中有机质积累和稳定是如何随着植稻年限而演进，其微生物、生物活性功能如何与有机质积累相变化，这是还没有清楚的问题。
　　在中国浙江东部沿海地区，垒土筑塘、围涂开垦，已有2000多年的历史，在围垦过程中，大量的滩涂湿地被开垦为水稻土。不同海塘的建筑年代均有较为可靠的历史记录，由此构成一个水稻土壤演变的时间序列。该时间序列由石灰性滨海沉积物发育而来，可作为研究长期植稻条件下土壤发生过程中土壤碳氮分布变化的一个模式系统。理解在长期农业利用过程中土壤是如何变化的，为进一步制定合理的土地利用策略和预测农业生态系统的发展提供科学依据。
　　由于土壤微生物在地球化学养分循环和土壤健康中重要的作用，有关土地利用方式的改变对微生物群落的影响，吸引了越来越多研究者的关注，但是，我们对长期种植水稻如何影响土壤微生物群落的了解较少。因此，为了阐明土壤的基本性质和微生物群落在本体土壤和不同粒径大小团聚体中随土壤演变过程的变化情况，我们将沿海滩涂(P0)和植稻年限为50-700年的水稻土(P50-P700)一起作为研究对象。分析土壤主要的理化性质用来理解基本的水稻土演变过程。采用BIOLOG微平板技术、定量PCR(qPCR)、末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、454高通量测序等微生物分子生态学技术，结合温室气体的产生和土壤酶活性的测定，研究分析了长期种植水稻对土壤中细菌、真菌和古菌的基因丰度和群落结构的影响。主要研究结果如下:
　　一.长期种植水稻对土壤的理化性质及微生物活性的影响
　　滩涂围垦后，种植水稻对土壤的理化性质产生了显著的影响。在700年的种植水稻过程中，主要的土壤性质的变化包括:土壤pH从8.62下降到6.65;土壤中的有机碳和总氮显著积累，分别由6.32和0.79 g kg-1增加到了21.70和2.14 g kg-1;粗砂粒级团聚体含量由2.78％增加到7.63％，提高了土壤的团聚性。土壤总DNA含量、总磷(TP)、可溶性有机碳(DOC)、微生物生物量碳(SMBC)和CEC在围垦后的50-100年间快速增加，在此之后随着土壤的继续发育保持相对稳定。我们发现不同植稻年限的水稻土经30天的淹水厌氧培养后，植稻土壤的CH4和CO2产生量要高于滩涂土壤，CH4和CO2分别增加了3.81倍和3.89倍。利用BIOLOG对土壤微生物的功能多样性研究后，香农指数（H'BIOLOG）、丰富度（SBIOLOG）在植稻100年间明显增加，在此之后趋于稳定。
　　在不同粒径的团聚体中，DNA含量、SOC和总N的含量存在明显差异。这些指标在粗砂粒和粘粒中要显著高于其他粒径的团聚体。一般来说，DNA含量、SOC和总N的含量在单个土壤样品中的分布规律是:粗砂粒（2000-200μm）＞粘粒（＜2μm）＞细砂粒（200-20μm）和粉粒（20-2μm）。而且，粗砂粒中的C/N也显著高于其他粒级的团聚体。
　　二.长期种植水稻对土壤中细菌群落的影响
　　随着围垦后植稻年限的延长，细菌16S rRNA基因丰度由最初的每克干土3.99×108拷贝数显著地增加到1.83×1010。与此同时，长期种植水稻对土壤中大部分的功能微生物和潜在的病原菌都有显著地影响。其中，拟杆菌门（Bacteroidetes）在最初的滩涂中的相对丰度最高(29.02％)，但在围垦后的100年间下降到了1.52％，在此之后一直处于较低的丰度水平。与此相反，酸杆菌门（Acidobacteria）在围垦后的300年间，相对丰度由3.44％增加到最大值17.91％。在700年的种植水稻过程中，硝化螺菌门（Nitrospirae）、δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）呈现逐渐增加的趋势，放线菌门(Actinobacteria)、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）和γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）则呈现逐渐下降的趋势，而β-变形菌纲（Betaproteobacteria）没有明显的变化趋势。细菌群落的OTU数、香农指数(H')、Chao1和系统发育多样性指数(PD)被用来估计和比较不同植稻年限水稻土中细菌的多样性和丰富度，结果发现，植稻土壤(P50-P700)中细菌群落的多样性和丰富度要远远高于围垦前滩涂中的细菌群落，且所有的多样性指数均在植稻100年后达到稳定。长期植稻条件下细菌群落的演变与pH、SOC、TN和SMBC呈显著相关，且与SOC的相关性最高(r=0.76，p＜0.001)。
　　三.长期种植水稻对土壤中古菌和产甲烷菌群落的影响
　　古菌16S rRNA基因和产甲烷菌mcrA基因丰度随植稻年限的延长都呈现出逐渐增长的趋势，分别由最初的每克干土6.70×106和1.53×105拷贝数增加到植稻700年时的每克干土2.89×108拷贝数和2.73×107。而古菌和产甲烷菌群落的多样性指数(H'、Chao和Dominance)在围垦之后显著增加并在植稻100年时达到最大。此外，虽然在围垦后的50年的植稻年限里，古菌和产甲烷菌群落的结构组成发生明显地改变，但是在不同植稻年限土壤中产甲烷菌群落中甲烷八叠球菌目（Methanosarcinales）一直处于优势地位。通过比较发现，在长期植稻过程中，产甲烷菌的群落结构较其基因丰度更快的达到相对稳定。围垦初期古菌群落快速的演替过程也与成土过程中土壤形态和矿物的演变相对应。这一迅速的演替过程可能与围垦后100年间土壤有机碳的快速积累有关。
　　四.长期种植水稻对不同粒径团聚体中微生物群落的影响
　　最高的细菌基因丰度和群落多样性分布在最大粒径（粗砂粒）和最小粒径（粘粒）团聚体中，而最高的真菌基因丰度和群落多样性只分布在最大粒径团聚体中。细菌和真菌的基因丰度在围垦后50年的植稻年限达到最大，在此之后保持相对的稳定，这一变化趋势主要表现在粗砂粒和粘粒中，在细砂粒和粘粒中并不明显。虽然不同粒径团聚体中细菌和真菌群落结构都存在明显的差异，但是相似性分析的结果表明，真菌群落在长期种植水稻过程中比细菌变异性大。
　　对于古菌和产甲烷菌，在粗砂粒和粘粒中的基因丰度较高。而且，长期植稻过程中，古菌和产甲烷菌在粗砂粒和粘粒中基因丰度和多样性的变化也比其他粒径中明显。对古菌16S rRNA基因测序分析后发现，Methanocellales广泛分布于各个团聚体粒径中并贯穿整个时间序列，甲烷八叠球菌科（Methanosarcinaceae）和甲烷鬃菌科（Methanosaetaceae）在粘粒中的分布极少。
　　不同植稻年限土壤中，砂粒和粉粒的SOC和总氮与微生物生物量（总DNA含量）存在显著地相关性，这表明SOC和总氮可能是土壤微生物生物量的主要影响因子。
　　五.长期植稻过程对耕层土壤不同深度细菌和真菌群落功能和结构的影响
　　对不同植稻年限耕层三个深度（0-5cm、5-10cm和10-20cm）的土壤进行分析后发现，细菌和真菌的基因丰度、酸性磷酸酶、蔗糖酶和脲酶与土壤发育年限存在显著地相关性，尤其表现在0-10cm土层。真菌的基因丰度和酸性磷酸酶与土壤深度成显著相关。而且，土壤发育年限与土壤深度所产生的交互作用对真菌丰度和酸性磷酸酶活性产生强烈的影响。另外，我们发现细菌群落结构随土壤深度的增加没有明显的变化，而真菌的群落结构随土壤深度的增加而明显变化。在三个土壤深度中，细菌和真菌群落的多样性在围垦后50-100年的时间内均持续增加，但在此之后达到相对的稳定。结合不同深度土壤中微生物群落结构与土壤酶活性可以提高我们对表层和表层以下土壤在长期种植水稻过程中，微生物群落结构和功能的认识。
　　综上所述，本研究提高了我们对长期植稻过程中，本体土壤和不同团聚体中的微生物（细菌、真菌和古菌）丰度和群落结构演变过程的认识。
　　利用由滩涂围垦所形成的时间序列，我们发现在长期种植水稻过程中，土壤中的生物和非生物因素的演变过程是不一致的。特别在本体土壤中，虽然细菌和古菌的基因丰度随土壤发育时间的延长而逐渐增加，但是它们的群落结构和多样性在围垦后的100年内迅速增加并达到稳定。相对于长期植稻过程中土壤形态和矿物特征的逐渐演变，土壤围垦初期有机碳的显著积累为微生物提供了良好的生存环境，促进了微生物群落和功能的快速形成。由此，细菌和古菌群落的演替可以分为两个阶段，在最初的几十年甚至上百年相对较短的时间内，群落多样性快速增加且群落结构快速变化;而在此之后几百年的较长的土壤发育过程中，微生物群落及多样性变化缓慢。
　　在土壤团聚体这一微生境中，不同植稻年限土壤中微生物（细菌、真菌和古菌）生物量的空间分布存在明显不同。不同粒径中细菌和真菌的基因丰度在围垦50年后达到最大，而古菌和产甲烷菌的基因丰度随植稻年限的延长而增加。但是，不同类群微生物的多样性随土壤发育时间的变化较为一致。
　　在700年的种植水稻过程中，无论是本体土壤还是不同的团聚体中大多数的微生物群落的变量都与土壤有机碳成显著相关，表明土壤有机碳可能是指示和调节土壤微生物群落演变的一个关键因素。
　　但是，微生物演变的机制和其与地球生物化学循环的潜在联系还需要进一步的研究。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1．1 土壤微生物在稻田生态系统中的作用和功能

1．1．1 土壤微生物对稻田土壤发育、肥力维持和养分循环具有重要意义

1．1．2 土壤微生物对水稻生长的作用

1．1．3 土壤微生物可以促进腐殖酸的形成

1．2 种植水稻对土壤微生物群落的影响

1．2．1 氧化还原条件对水稻土壤微生物群落结构的影响

1．2．2 施肥对水稻土壤微生物群落结构的影响

1．2．3 土壤团聚体对水稻土壤微生物群落结构的影响

1．3 水稻土的形成和演变

1．3．1 植稻年限对土壤理化性质的影响

1．3．2 植稻年限对土壤微生物活性的影响

1．3．3 土壤微生物群落对植稻年限的响应

1．4 土壤微生物的研究方法及应用

1．4．1 磷脂脂肪酸法(Phospholipid Fatty Acid，PLFA)

1．4．2 BIOLOG微平板分析方法

1．4．3 荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ Hybridization，FISH)

1．4．4 变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient Gel Electrophresis，DGGE)

1．4．5 限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)

1．4．6 克隆文库(Clone library)

1．4．7 焦磷酸测序(Pyrosequencing)

1．5 本论文研究的目标、内容和技术路线

1．5．1 研究目的和意义

1．5．2 研究内容

1．5．3 技术路线

第二章 不同植稻年限土壤理化性质和微生物活性及功能

2．1 前言

2．2 材料方法

2．2．1 研究区域概况

2．2．2 土壤采集和处理

2．2．3 土壤的粒组分级

2．2．4 土壤常规理化性质分析

2．2．5 厌氧培养实验测定CO2和CH4的产生量

2．2．6 土壤微生物群落功能多样性分析(BIOLOG)

2．2．7 统计分析

2．3 结果分析

2．3．1 长期种植水稻对土壤基本性质的影响

2．3．2 不同植稻年限水稻土CO2和CH4的产生

2．3．3 不同植稻年限水稻土中微生物的功能多样性的比较

2．3．4 长期种植水稻条件下各团聚体的组成及其C、N含量的变化

2．3．5 长期种植水稻条件下本体土壤和各团聚体中总DNA、SOC和TN含量的相关性分析

2．4 讨论

2．4．1 长期种植水稻条件下土壤基本理化性质和团聚体的演变特征

2．4．2 长期种植水稻条件下土壤呼吸和微生物群落功能的变化

2．4．3 土壤有机碳和总氮是影响微生物生物量的重要因子

2．5 小结

第三章 长期种植水稻对土壤中细菌群落的影响

3．1 引言

3．2 材料方法

3．2．1 供试土壤

3．2．2 土壤微生物总DNA的提取

3．2．3 定量PCR测定细菌群落丰度

3．2．4 基于454-高通量测序的细菌群落结构分析

3．2．5 数据处理

3．3 结果分析

3．3．1 不同植稻年限土壤中细菌基因丰度的变化

3．3．2 不同植稻年限土壤中高通量测序的分类总结

3．3．3 不同植稻年限土壤中细菌群落多样性的变化

3．3．4 长期植稻过程中土壤细菌群落结构变化的影响因素

3．4 讨论

3．4．1 长期种植水稻对土壤细菌基因丰度的影响

3．4．2 长期种植水稻对土壤细菌主要门类的影响

3．4．3 长期种植水稻对土壤中功能微生物和可能的病原菌的影响

3．4．4 环境因子在微生物群落演替过程中的影响

3．4．5 长期种植水稻对土壤微生物群落多样性的影响

3．5 小结

第四章 长期种植水稻对土壤中古菌群落的影响

4．1 引言

4．2 材料方法

4．2．1 供试土壤

4．2．2 土壤微生物总DNA的提取

4．2．3 定量PCR测定古菌和产甲烷古菌群落丰度

4．2．4 末端限制性片段多态性分析(T-RFLP)

4．2．5 克隆文库构建以及系统发育分析

4．2．6 末端限制性酶切片段(T-RFs)的识别

4．2．7 数据处理

4．3 结果分析

4．3．1 不同植稻年限土壤中古菌和产甲烷古菌丰度的变化

4．3．2 不同植稻年限土壤中古菌和产甲烷古菌群落结构T-RFLP分析

4．3．3 古菌16S rRNA和产甲烷古菌mcrA基因克隆文库分析

4．3．4 古菌和产甲烷古菌限制性片段的识别和系统进化分析

4．3．5 土壤理化性质、古菌和产甲烷菌丰度和多样性的相关性分析

4．4 讨论

4．4．1 长期种植水稻对土壤中古菌和产甲烷古菌丰度的影响

4．4．2 长期种植水稻对土壤中古菌和产甲烷古菌群落结构的影响

4．4．3 长期种植水稻对土壤中古菌和产甲烷菌的生物多样性的影响

4．5 小结

第五章 长期种植水稻对不同土壤团聚体粒组中微生物基因丰度和群落结构的影响

5．1 前言

5．2 材料方法

5．2．1 供试土壤

5．2．2 土壤样品的采集和处理

5．2．3 土壤的团聚体粒组分级

5．2．4 土壤理化性质的测定

5．2．5 土壤微生物总DNA的提取和定量PCR检测细菌、真菌、古菌及产甲烷菌基因丰度

5．2．6 末端限制性片段多态性分析(T-RFLP)分析不同团聚体粒组中细菌和真菌群落结构

5．2．7 变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析古菌群落结构

5．2．8 DGGE条带切胶回收和克隆测序

5．2．9 系统进化分析

5．2．10 数据处理

5．3 结果分析

5．3．1 不同植稻年限土壤中各团聚体粒组微生物基因丰度的变化

5．3．2 不同植稻年限土壤中各团聚体粒组细菌和真菌群落结构的变化

5．3．3 不同植稻年限土壤中各团聚体粒组古菌群落结构的变化

5．3．4 特异条带克隆测序和系统进化分析

5．3．5 不同植稻年限土壤中各团聚体粒组微生物群落多样性的变化

5．4 讨论

5．4．1 不同团聚体粒组大小对土壤中细菌、真菌和古菌基因丰度的影响

5．4．2 长期植稻对土壤中不同团聚体粒组中细菌、真菌和古菌基因丰度的影响

5．4．3 长期植稻对土壤中不同团聚体粒组中微生物群落结构的影响

5．4．4 长期植稻对土壤中不同团聚体粒组中微生物群落多样性的影响

5．5 小结

第六章 长期种植水稻对耕层不同深度土壤细菌和真菌基因丰度和群落结构的影响

6．1 前言

6．2 材料方法

6．2．1 供试土壤

6．2．2 土壤样品的采集和处理

6．2．3 土壤理化性质的测定

6．2．4 红外光谱(FTIR)分析

6．2．5 土壤酶活性的测定

6．2．6 土壤微生物总DNA的提取和定量PCR检测细菌和真菌基因丰度

6．2．7 变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析细菌和真菌的群落结构

6．2．8 DGGE特异条带克隆测序系统进化分析

6．2．9 数据处理

6．3 结果分析

6．3．1 不同植稻年限耕层土壤中各深度理化性质的变化

6．3．2 不同植稻年限耕层土壤中各深度细菌和真菌基因丰度的变化

6．3．3 不同植稻年限耕层土壤中各深度酶活性的变化

6．3．4 植稻年限与土壤深度对土壤微生物丰度和活性的交互作用

6．3．5 不同植稻年限耕层土壤中各深度细菌和真菌群落结构的变化

6．3．6 特异条带克隆测序和系统进化分析

6．4 讨论

6．4．1 长期植稻条件下耕层不同深度土壤理化性质和微生物的分布

6．4．2 长期种植水稻对耕层土壤不同深度微生物基因丰度及活性的影响

6．4．3 长期种植水稻对耕层土壤不同深度细菌和真菌群落的影响

6．5 小结

第七章 综合讨论、全文结论、创新点及展望

7．1 综合讨论

7．1．1 长期种植水稻过程中土壤特征及其随时间的演变关系

7．1．2 长期植稻条件下土壤微生物群落、多样性的演变

7．1．3 长期植稻过程中细菌和古菌群落的演变速度要快于土壤的演变

7．2 全文结论

7．3 创新点

7．4 研究不足与展望

参考文献

攻读博士硕士期间发表论文

致谢