家蚕非减数分裂孤雌生殖转录水平和蛋白质水平以及生理生化指标的相关机理研究

摘要

家蚕温汤诱导非减数分裂孤雌生殖是人工诱导孤雌生殖的成功模型之一。热激诱导的家蚕非减数分裂孤雌生殖，后代完全拷贝了母本的基因型。但是，随着选拔代数的增加，家蚕孤雌生殖能力逐渐提高且趋于稳定，进而构建了许多具有高孤雌生殖能力的孤雌生殖品系。家蚕非减数孤雌生殖先前的研究主要集中在诱导方法的研发、影响因素的探讨、孤雌生殖系的构建及应用，关于其相关分子机理研究相对较少。
　　为了深入了解家蚕孤雌生殖机理，进而更好的开发和利用孤雌生殖系，根据国内外孤雌生殖诱导、机理相关研究和本实验室的家蚕孤雌生殖生殖系诱导构建分析结果，本研究从转录组水平、蛋白质水平和生理生化水平比较了孤雌生殖系与有性生殖系的差异，探求家蚕孤雌生殖发生相关的基因及其表达蛋白，并尝试探讨温汤诱导家蚕家蚕孤雌生殖的发生和调控机理。
　　1.家蚕孤雌生殖系与其原始亲本有性生殖系卵转录组比较分析
　　利用RNA-seq技术对热激前后的家蚕孤雌生殖系与原始亲本有性生殖系卵内转录组进行了高通量测序，并与家蚕基因组进行了比对和RT-qPCR验证，然后进行了功能和通路富集分析。结果显示:热激前后两品系间分别有538个和545个差异表达基因;且有418个基因在热激前后都具有表达差异。差异表达基因功能富集分析显示:差异表达基因主要涉及到细胞生物发育、细胞周边发育过程中相关繁殖和繁殖等生物代谢途径;通路富集分析显示:品系间热激前后差异表达基因没有富集通路存在，代谢途径是含差异基因较多的通路。同时发现一些表达差异大的基因与孤雌生殖发生有一定的关联。
　　2.家蚕孤雌生殖系诱导过程蛋白质组学研究
　　利用蛋白质组学技术分析了具有高孤雌生殖能力孤雌生殖系(无14)的诱导过程蛋白表达变化情况，从蛋白质水平上探究了家蚕热激非减数分裂孤雌生殖得以成功发生的原因。研究发现:随着诱导的进行，不同阶段卵内一些蛋白表达发生了改变。其中，热激期间Ran-GTP结合核蛋白的高表达与纺锤体的重新形成有关，也是停滞减数分裂重启的关键;核糖体蛋白S12、热激蛋白-20.4和热激蛋白-19.5表达量的改变与温度改变的细胞应激相关;同时随着诱导的进行，卵内卵巢丝氨酸蛋白酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、细胞色素氧化酶亚基I等与能量代谢相关的蛋白表达量也随之发生了改变。
　　3.家蚕孤雌生殖系与其原始亲本有性生殖系卵比较蛋白质组学研究
　　对孤雌诱导过程中孤雌生殖系与原始亲本有性生殖系不同时期的卵及其孵化蚁蚕的蛋白质组成进行了差异比较，试图通过分析在孤雌生殖能力存在显著差异品系间的差异表达蛋白来探讨孤雌生殖发生机理，结果显示:品系间同一时期卵、蚁蚕样本间存在若干差异表达蛋白，经质谱分析鉴定，Ran-GTP结合核蛋白、肌动蛋白解聚因子等与纺锤体形成有关的蛋白在孤雌生殖系上调表达，而包括3个肌动蛋白（肌肉蛋白-20、肌动蛋白-肌型A1和β-肌动蛋白）和表皮蛋白RR-1基序19等蛋白在品系间蚁蚕发生了表达量的改变。卵内Ran-GTP结合核蛋白、肌动蛋白解聚因子是纺锤体重新形成的关键因素;蚁蚕里肌动蛋白、表皮蛋白和信息结合蛋白等蛋白的差异表达显示两品系的蚁蚕发育进度存在差异。
　　4.家蚕孤雌生殖系与其原始亲本有性生殖系蛹期卵巢比较蛋白质组学研究
　　通过对孤雌生殖能力具有显著差异的孤雌生殖系与其原始亲本有性生殖系的蛹期卵巢的蛋白质组成进行了比较分析，探讨品系间卵巢蛋白表达差异与卵子发生调控间关系，结果显示:较亲本有性生殖系卵巢相比，高孤雌生殖能力的孤雌生殖系卵巢蛋白组成发生了改变，丝氨酸蛋白酶、组织蛋白酶D等一些蛋白水解酶类在孤雌生殖系卵巢内表达上调，而类脂蛋白（低分子量30kD脂蛋白PBMHPC-19、低分子量30 kDa载脂蛋白19G1前体）则表达量则呈现下调趋势，推测孤雌生殖系卵巢内卵子的发生过程中30K蛋白合成少。孤雌生殖系卵巢内蛋白水解酶高表达加速卵黄蛋白的合成，30K蛋白低表达显示两品系的卵黄蛋白组成可能存在差异，孤雌生殖系卵黄其他组成可能合成更多，是蛋白水解酶高表达的原因。
　　5.家蚕孤雌生殖系与原始亲本有性生殖系卵内构成成分差异比较
　　为了了解卵内营养物质对孤雌生殖发生的影响，进一步探索家蚕孤雌生殖发生机理，比较了家蚕孤雌生殖系和亲本有性生殖系不同处理时期的卵内构成成分的差异。结果发现:卵内蛋白质、不同的糖类及其相关的酶类和激素存在着差异，这种差异可能跟两品系孤雌生殖能力差异相关。特别是蛋白质含量的差异预示着卵内机体构建活动程度差异，而海藻糖高含量以及热激期山梨醇含量的急剧增加有效地保护了卵内分子免受热激影响，因此GSH、GST参与的解毒系统也不活跃。同时发现一些内源性激素跟孤雌生殖能力没有相关性。
　　总之，具有亲缘关系但孤雌生殖能力具有差异的品系在卵子生成调控上具有差异，由此导致生成的卵子在基因表达、蛋白表达及山梨醇等物质的含量方面产生差异。这种差异调控可能与孤雌生殖发生有关，然而，具体调控机制还需要进一步研究。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词(Abbreviation)

第一章 家蚕孤雌生殖研究进展

1 家蚕孤雌生殖的自然观察研究

2 家蚕孤雌生殖的人工诱导研究

2．1 家蚕人工孤雌生殖物理刺激方面研究

2．2 化学物质刺激

2．3 其他形式刺激

3 家蚕孤雌生殖的遗传资源调查和遗传学分析

3．1 品种间差异调查

3．2 家蚕孤雌生殖遗传分析

3．3 卵巢移植

4 家蚕孤雌生殖的细胞水平、分子水平研究

5 家蚕孤雌生殖系的构建与应用

5．1 家蚕孤雌生殖系的选拔和构建

5．2 家蚕孤雌生殖系的生产应用

参考文献

第二章 孤雌生殖转录组与蛋白质组的研究进展

1 生物化学检测

1．1 常见生物化学检测技术

1．2 生物化学检测技术在孤雌生殖研究中的应用

2 转录组和蛋白组

2．1 转录组及其研究方法

2．2 RAN-Seq技术与孤雌生殖机理研究

2．3 家蚕转录组学研究

3 蛋白质组及其研究方法

3．1 蛋白质组介绍和方法

3．2 双向电泳技术

3．3 孤雌生殖蛋白质组学研究

4 本项目的目的和研究意义

参考文献

第三章 家蚕孤雌生殖系与其原始亲本有性生殖系转录组比较分析

1 材料与方法

1．1 材料和试剂

1．2 主要仪器与试剂

1．3 方法与步骤

1．7 RNA提取和实时定量PCR分析

2 结果与分析

2．1 品系表型间的差异

2．2 RNA提取质量评估

2．3 测序质量评估

2．4 参考序列对比

2．5 可变剪切分析

2．6 新转录本预测

2．7 SNP和InDel分析

2．8 基因表达水平分析

3 讨论

3．1 品系间

3．2 热激后

4 结论

参考文献

第四章 家蚕孤雌生殖系孤雌诱导过程蛋白质组学研究

1 材料与方法

1．1 材料及制备

1．2 仪器与试剂

1．3 等电聚焦电泳(isoelectric focusing electrophoresis，IEF)和平衡

1．4 十二烷基聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)与染色

1．5 蛋白质双向电泳图谱分析

1．6 质谱分析和蛋白鉴定

1．7 RNA提取和实时定量PCR(RT-q PCR)分析

2 结果

2．1 家蚕孤雌生殖系诱导过程中不同时期卵蛋白质图谱分析

2．2 蛋白图谱比较分析

2．3 差异蛋白质谱鉴定及生物信息学分析

2．4 差异蛋白的RT-qPCR分析

3 讨论

4 结论

参考文献

第五章 家蚕孤雌生殖系与其原始亲本有性生殖系卵比较蛋白质组学研究

1 材料与方法

1．1 材料及制备

1．2 仪器与试剂

1．3 IEF和平衡

1．4 SDS-PAGE电泳与染色

1．5 双向电泳图谱分析

1．6 质谱分析和蛋白鉴定

1．7 RT-q PCR

2 结果

2．1 家蚕孤雌生殖系与其亲本有性生殖系不同时期卵、蚁蚕蛋白质图谱

2．2 品系间差异表达蛋白质的统计分析

2．3 差异蛋白质谱鉴定及生物信息学分析

2．4 差异蛋白的RT-qPCR分析

3 讨论

4 结论

参考文献

第六章 家蚕孤雌生殖系与其亲本有性生殖系蛹期卵巢比较蛋白质组学研究

1 材料与方法

1．1 材料及制备

1．2 仪器与试剂

1．3 IEF和平衡

1．4 SDS-PAGE电泳与染色

1．5 双向电泳图谱分析

1．6 质谱分析和蛋白鉴定

1．7 RT-q PCR验证

2 结果

2．1 家蚕孤雌生殖系与其原始亲本有性生殖系不同时期卵巢蛋白质图谱

2．2 差异蛋白质谱分析

2．3 MALDI-TOF／TOF-MS分析及生物信息学分析

2．4 差异蛋白的RT-qPCR分析

3 讨论

4 结论

参考文献

第七章 家蚕孤雌生殖系与原始亲本有性生殖系卵内构成成分差异比较

1 材料与方法

1．1 样品收集

1．2 主要仪器设备

1．3 主要试剂

1．4 试验方法

2 结果

2．1 两品系间蛋白浓度差异

2．2 两品系间谷胱甘肽及谷胱甘肽转移酶含量差异

2．3 海藻糖及海藻糖酶在两品系间的含量及活性

2．4 山梨醇及山梨醇脱氢酶在两品系间的含量及活性

2．5 糖原及葡萄糖在两品系间的含量

2．6 保幼激素及蜕皮激素在两品系间的含量

3 讨论

4 结论

参考文献

全文总结

创新点

致谢

攻读博士期间发表论文