大豆疫霉中参与氧化压力应答和致病过程的转录因子PsHSF1和PsBZPc32的功能分析

摘要

疫霉菌隶属于茸鞭生物界卵菌门，与真菌的遗传距离相距甚远，大多数生化途径、侵染机制、结构特征都与真菌存在显著的差别，这导致许多传统杀真菌剂不能有效地用于疫霉病的防治。从分子水平上对疫霉菌的致病机制进行研究是寻找针对疫霉菌的新杀菌剂作用靶标和设计植物疫病控制策略的重要理论基础。转录因子是基因表达调控网络中的关键因子，参与病原菌生长发育、应答各种外界胁迫和致病等过程。随着越来越多的疫霉菌基因组测序完成，寻找疫霉菌特异的转录因子，解释其对疫霉菌生长发育和致病的作用机理，对认识这类独特的病原生物，筛选控制这类病原菌的新杀菌剂作用靶标具有重要意义。本研究以大豆疫霉为研究对象，期望通过挖掘大豆疫霉中调控致病过程和外界胁迫应答过程的关键转录因子，研究其调控机制，揭示卵菌发育与致病的分子机理，为新型卵菌杀菌剂的研发提供独特的分子靶标。
　　主要研究内容如下:
　　大豆疫霉热激转录因子HSF家族基因的鉴定及转录分析:热激转录因子(HSFs)是细胞应答热激胁迫和多种化学刺激的信号传递链上的终端组分，它们通过识别热激元件(HSE)特异调节靶标基因的转录水平，从而对逆境做出应答。通过生物信息学分析对大豆疫霉、橡树疫霉和致病疫霉的全基因组数据库中含有HSF DNA结合域的基因序列进行挖掘，从三个疫霉种中鉴定到大量HSF编码基因（17～24个），发现其数目远远高于真菌中HSFs，而与绿色植物中的相近。本文首先对疫霉菌基因组中编码HSF转录因子的基因model进行了校正。通过序列、基因组结构和进化等分析，发现疫霉中HSFs在基因组上具有成簇排列的特征。不同疫霉种间的同源基因序列相似性高，而与动物、植物和真菌中的同源基因进化距离相距甚远，因此在进化树上自成一支。推测疫霉属的HSFs数量的扩增是由该分支共同的祖先基因在基因组中不断复制而来的。此外，还利用实时定量RT-PCR对大豆疫霉中所有HSF编码基因在无性生活史、侵染各个阶段以及氧化压力条件下的转录水平进行分析，发现HSFs存在多样化的转录模式。这为寻找压力应答相关的HSF转录因子提供方向，并为寻找潜在的大豆疫霉杀菌剂靶标提供了理论基础。
　　HSFs参与调控大豆疫霉氧化压力应答和抑制植物防卫反应:活性氧在植物防卫反应中扮演着十分重要的角色，而疫霉菌适应这些植物产生的活性氧并进行应答的机制目前尚不清楚。在大豆疫霉全基因组数据库中搜索已报道的参与调控氧化应压力应答转录因子的同源序列，并进行相关基因的转录水平分析，发现一个热激转录因子PsHSF1在氧化压力条件下和休止孢萌发阶段显著上调表达。进一步研究发现大豆疫霉PsHSF1沉默转化子对氧化压力耐受性降低，并且致病性受到严重影响。通过对侵染过程进行细胞学观察，发现PsHSF1沉默转化子在侵染大豆过程中不能抑制植物防卫反应所产生的活性氧的积累和侵染位点胼胝质的形成;而外源添加还原剂GSH可促使活性氧积累量明显减少，并且侵染菌丝在植物组织中扩展增加。通过对胞外酶活性检测，发现PsHSF1沉默转化子胞外氧化酶和漆酶的活性都明显低于野生型。进一步对PsHSF1沉默转化子中胞外氧化酶和漆酶编码基因的转录水平进行检测，发现多个基因转录水平受到影响。对其中一个漆酶编码基因PsLAC4进行瞬时沉默，发现其对PsHSF1沉默所产生的表型有所贡献。上述结果表明，PsHSF1可能通过调控胞外氧化酶相关编码基因的表达而在抑制活性氧介导的植物防卫反应中起重要作用。
　　转录因子PsBZPc32在大豆疫霉生长发育及致病过程中的功能研究:bZIP(Basicleucinezipper)家族基因是一类在真核生物中普遍存在且极具序列多样性的转录因子，它们在动物、植物、真菌的生长发育和压力应答过程中起重要功能。基于本实验室之前对大豆疫霉bZIP转录因子的系统分析，从中筛选一个在侵染早期上调表达的基因PsBZPc32进行功能分析。PsBZPc32是大豆疫霉71个bZIP转录因子中唯一含有bZIP结构域外其他功能域——PAS结构域的蛋白。PsBZPc32沉默后导致大豆疫霉休止孢萌发率显著降低和萌发后产生的微菌丝形态异常率增加。休止孢萌发产生的微菌丝极性生长受到影响，呈现多分枝的树状形态，并且其细胞壁表面多糖组分分布异常。PsBZPc32突变体对大豆感病品种合丰47的致病力显著下降，通过显微观察发现其能穿透寄主表皮，但是侵入的菌丝不能进一步扩展，并发现在植物侵染位点有大量活性氧积累。此外，还发现PsBZPc32沉默转化子对过氧化氢的耐受性降低。上述结果表明，大豆疫霉PsBZPc32是一个参与侵染相关结构发育、氧化压力应答和致病过程关键因子。
　　PsBZP32调控氧化压力应答和致病过程的分子机制研究:bZIP转录因子在真核生物生长发育过程和应答外界压力过程的基因表达调控网络中起着十分重要的功能。对大豆疫霉中参与侵染相关结构的发育、致病过程和氧化压力应答过程的关键转录因子PsBZPc32，从其自身翻译后水平调控和对下游基因的转录调控两层面对其进行分子调控机制探索。通过磷酸化位点预测，发现PsBZPc32有多个潜在的磷酸化位点，并在大豆疫霉侵染3小时阶段的磷酸化组数据中发现其中的2个位点被磷酸化。在氧化压力下条件下，PsBZPc32在细胞质中出现多个磷酸化状态，并且其定位趋于从细胞质中转移至细胞核中。对大豆疫霉侵染3小时阶段磷酸化组数据中发现两个位点进行突变后进行亚细胞定位观察，发现这两个位点与PsBZPc32定位于细胞核密切相关。在PsBZPc32沉默转化子中，发现多个效应分子在侵染阶段的转录水平与野生型中相比显著降低。为了对PsBZPc32调控的下游基因有更全面的了解，将PsBZPc32沉默转化子、过表达转化子以及野生型菌株侵染3小时阶段的样品进行数字基因表达谱分析，发现有215个基因在沉默转化子和过表达突变中呈现出相反的转录变化模式，其中多组基因与PsBZPc32沉默转化子表型密切相关。上述研究结果表明，PsBZPc32通过磷酸化状态和亚细胞定位改变等自身翻译后水平的调控实现对氧化压力应答;通过调控效应分子、细胞骨架蛋白和氧化还原蛋白、信号传递途径蛋白等相关编码基因的转录实现其在致病过程、氧化压力应答过程和休止孢萌发过程中的功能。

目录

声明

摘要

引言

上篇 文献综述 真菌和卵菌中转录因子调控致病过程的研究进展

1 植物病原真菌和卵菌的致病过程

1．1 植物病原真菌和卵菌的生活史和病害循环

1．2 以稻瘟病菌为例的植物病原真菌侵染机制

1．3 以疫霉菌为例的植物病原卵菌侵染机制

2 参与致病过程转录因子的功能鉴定

2．1 利用生物信息学系统鉴定转录因子

2．2 利用转录分析寻找致病相关转录因子

2．3 建立突变体库寻找调控致病过程的转录因子

2．4 获得突变体鉴定转录因子如何参与致病过程

3 转录因子参与致病过程的调控机制研究

3．1 bZIP转录因子

3．2 HSF转录因子

3．3 锌指结构转录因子

3．4 其他类型转录因子

4 转录因子调控机制的研究方法

4．1 转录因子的翻译后水平调控

4．2 转录因子靶标基因的鉴定

参考文献

下篇 研究内容

第一章 大豆疫霉热激转录因子HSF家族基因的鉴定及转录分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第二章 PsHSF1参与调控大豆疫霉氧化压力应答和抑制植物防卫反应

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第三章 转录因子PsBZPc32在大豆疫霉生长发育及致病过程中的功能研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第四章 PsBZPc32调控氧化压力应答和致病过程的分子机制研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

附表

全文总结及创新点

攻读博士学位期间发表的研究论文

致谢