荷花NnγGCS基因克隆、表达及功能验证

摘要

荷花属睡莲科莲属挺水植物。花大、瓣型丰富且颜色艳丽，大多分布于淡水水域，抗性强，观赏价值和经济价值都较高，是深受大众欢迎的水生植物之一。本研究从荷花中克隆得到荷花谷氨酰半胱氨酸合成酶基因（NnγGCS），分析其时空表达模式，通过转化拟南芥进而研究荷花NnγGCS基因功能，从分子水平探讨荷花重金属抗性机理，为利用基因工程技术提高荷花抗逆能力提供理论依据。
　　1.利用RACE-PCR技术从荷花‘台城拂翠’的叶片中克隆谷氨酰半胱氨酸合成酶基因NnγGCS，该基因全长1801 bp，开放阅读框(ORF)1569 bp。推导的氨基酸序列具有典型的GCS2基因家族结构域。系统进化分析表明荷花γGCS属于双子叶植物类，与龙眼，百脉根亲缘关系较近。
　　2.利用荧光定量（Real-Time PCR）技术，分析NnγGCS在荷花不同器官及镉胁迫下的表达情况。结果表明NnγGCS在荷花各器官均有表达，属组成型基因。各器官表达量从高到低依次为:嫩叶最高，其次叶柄，成熟叶，根须，剑叶，茎最低。镉胁迫下，NnγGCS在叶片和根部的表达都有不同程度的响应。不同浓度镉处理后，NnγGCS在叶片表达变化趋势相同，均为先下降后上升，且高浓度镉处理下基因表达水平更高。然而在根部，不同浓度镉处理后，NnγGCS表达变化并不相同，低浓度镉响应更快，高浓度镉反而响应迟钝。
　　3.在200μM和400μMCd2+胁迫下，测定荷花各器官镉积累量，结果表明荷花的根须和叶片是主要的镉积累器官。叶片中镉积累量高达1000μg/g干重。在根茎中积累量最少，仅80μg/g干重。
　　4.构建了荷花NnγGCS正义表达载体，并利用基因枪轰击洋葱表皮细胞技术进行亚细胞定位实验，结果表明NnγGCS基因定位于细胞质。通过农杆菌侵染拟南芥花序法将NnγGCS基因导入拟南芥，经潮霉素抗性筛选及PCR检测，获得3株转基因株系(T1-1，T1-2，T1-3)。荧光定量结果表明T1-3中目的基因表达量最高。在含镉培养基上播种野生型和转基因拟南芥T3代种子，比较其发芽率，结果表明转基因株系发芽率高于野生型。根系生长也比野生型旺盛，生长量大于野生型。用100μMCd2+处理后，野生型拟南芥膜脂过氧化程度大于转基因植株，抗氧化酶活性也高于转基因植株。

目录

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摘要

缩略词

引言

第一章 文章综述

1 重金属及其危害

2 水体重金属污染现状

3 重金属修复方法

3．1 物理化学修复方法

3．2 农业生态修复技术

3．3 生物修复技术

4 植物的重金属抗性机制

4．1 螯合作用

4．2 区室化作用

4．3 细胞修复

5 基因工程在植物修复中应用

6 植物修复应用前景

第二章 荷花NnyGCS基因克隆及序列分析

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 试剂与仪器

1．3 实验方法

2 结果与分析

2．1 RNA提取质量与反转录效果检测

2．2 目的中间片段序列测定

2．3 RACE-PCR结果

2．4 荷花NnyGCS基因全长序列的获得

2．5 氨基酸序列同源性比对

2．6 荷花NnyGCS基因氨基酸序列系统进化树构建

3 讨论

第三章 NnyGCS基因表达与亚细胞定位

第一节 镉胁迫后NnyGCS在荷花中表达分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 NnyGCS基因亚细胞定位

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 荷花NnyGCS基因的功能分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

1．3 筛选阳性拟南芥

1．4 荷花NnyGCS基因在拟南芥中功能验证

2 结果与分析

2．1 转基因拟南芥鉴定

2．2 镉胁迫下根长比较

2．3 镉胁迫下发芽率比较

2．4 镉胁迫下拟南芥植株生长量变化

2．5 镉胁迫下植株内生理指标变化

3 讨论

全文结论

创新之处

参考文献

附录

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致谢