青虾卵黄蛋白原和卵黄蛋白原受体基因的克隆及功能研究

摘要

青虾学名日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)俗称河虾，广泛分布在我国淡水水域。属于节肢动物门(Arthropoda)，甲壳纲(Crustacea)，十足目(Decapoda)，长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium)。近年来，随着青虾养殖产业的规模化扩大、年产量的提高，在生产中出现了一系列亟待解决的难题，其中青虾个体小型化“性早熟”问题最为突出。在养殖池塘中小虾性腺过早成熟产卵，导致青虾个体变小、池塘养殖密度过大、多代同堂等一系列问题，制约着青虾产业的可持续健康发展。性腺的成熟与生殖调控基因密切相关，参与生殖调控的基因很多，其中卵黄蛋白原(Vitellogenin, Vg)和卵黄蛋白原受体(Vitellogenin recep tor, VgR)在卵子发生过程中起着十分关键的作用。目前，在青虾中曾经克隆了Vg基因的短片段，但对于其功能研究还未见报道，关于VgR基因的研究还十分薄弱。本研究以青虾为研究对象，拟开展卵黄蛋白原基因和卵黄蛋白原受体基因的研究，根据实验室已构建的精卵巢文库获取的基因短片段，采用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)技术克隆获得了Vg基因和VgR基因的全长cDNA序列，并研究了在不同组织、成体不同发育时期、卵巢不同发育时期的表达规律;与此同时，通过眼柄摘除和RNAi，研究了Mn-VgR和Mn-Vg基因的功能以及在卵子发生过程中之间的相互调控关系。
　　采用RACE技术获得青虾Vg基因的全长cDNA序列全长约7804bp，ORF共编码2536个氨基酸残基，蛋白分子量为286.810 kDa，荧光定量结果表明，Mn-Vg基因在雌虾的肝胰腺、血淋巴和卵巢中高表达，其中肝脏表达量最高。在雄虾的各个组织基本不表达。Mn-Vg在胚胎发育的原肠期和溞状幼体期表达量较高。在出膜第一天表达量达到峰值，之后一直降低，在变态后第20天开始表达并持续升高。随着卵巢的发育，Mn-Vg在卵巢和肝脏中都呈现先升高后下降的趋势，在肝脏中，Mn-Vg在卵巢发育的第Ⅱ期开始升高并在第Ⅲ期达到峰值，随着卵巢产卵表达量降低。在卵巢中，Mn-Vg表达量在卵巢发育的第Ⅱ期开始时上升到成熟期Ⅴ期达到峰值，随着卵巢产卵表达量降低。眼柄摘除后，通过解除眼柄中激素对性腺的抑制作用，从而加速了卵巢的发育。 Mn-Vg在肝脏和卵巢中表达量和对照组相比都明显升高，在肝脏中升高的幅度更大。在一次注射实验中，通过注射4ug/g的Vg dsRNA明显降低了卵巢和肝脏中Mn-Vg的表达。在注射后的第五天Mn-Vg表达量分别降低到原来水平的3％和8％。二次注射实验组，发现Vg dsRNA能够显著的延缓卵巢发育的速度。VgRNAi还能够下调卵巢中VgR基因的表达，表明了两者之间重要的调控关系。
　　根据RACE技术和实验室已构建的文库，克隆获得了Mn-VgR基因全长cDNA为5920bp，其中5'末端非翻译区(Untranslated Regions，UTR)为45 bp，开放阅读框ORF(Open Reading Frame，ORF)为5709 bp、3'UTR为166 bp。Mn-VgR基因的开放阅读框共编码1902个氨基酸残基分子量为209kDa。Mn-VgR氨基酸序列具有LDL家族典型的保守结构域如:配体结合区域（Ligand-binding domain, LBD）、表皮生长因子(epidermal growth factor-precursor, EGF)前体结构域、O-连接的结构域、跨膜区域和胞内区。荧光定量PCR结果表明，Mn-VgR只在卵巢中高表达，在肝脏和肌肉中表达量较低，其他组织中几乎不表达。Mn-VgR在胚胎发育的卵裂期表达水平最高，之后表达水平逐步降低且一直处于低水平。在变态后的第20天开始表达，并逐渐升高。随着卵巢的发育，Mn-VgR在卵巢发育的第Ⅰ期表达逐渐升高并在第Ⅲ期到达峰值，之后一直处于较低水平，在生殖蜕皮之后进入下一个卵巢发育周期。眼柄摘除引起了卵巢和肝脏中Mn-VgR在卵黄发生过程中的显著升高(P＜0.05)。在成体雌虾中，根据性腺发育指数(Gonado somatic index, GSI)变化规律，表明VgRRNAi能够延缓性腺发育的周期。4ug/gVgR dsRNA之后，卵巢中VgR的表达量显著降低，在第五天下降了92％。同时VgR RNAi也引起了卵巢中Mn-Vg含量的降低和肝脏中Mn-Vg表达量的升高。
　　本研究首次克隆了青虾Vg和VgR的全长cDNA序列，确定了Vg-和VgR在不同组织、不同发育时期以及卵巢不同发育时期的表达规律进行了时空表达模式。首次运用眼柄摘除和RNAi技术，确定了Mn-VgR和Mn-Vg基因的功能以及相互之间的调控关系。结果表明Vg和VgR在卵巢发育成熟过程中承担重要的功能。实验结果对于青虾卵子成熟机制的研究有重要的意义。通过对Vg和VgR之间调控关系的研究，为甲壳类卵子发生过程中的分子调控机制的研究提供了理论依据。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

第一节 甲壳动物卵子发生相关基因研究进展

1．卵黄蛋白原和卵黄蛋白原受体基因

2．Vasa基因

3．PL10基因

4．Gustavus基因

5．周期蛋白家族基因

6．组织蛋白酶家族

7．热休克蛋白基因

8．其它相关基因

第二节 本研究的目的意义

第二章 青虾卵黄蛋白原基因的克隆、表达及功能研究

第一节 青虾卵黄蛋白原基因的克隆及序列分析

1 实验材料

2 实验方法

3 结果与分析

4．讨论

第二节 青虾卵黄蛋白原基因的时空表达分析

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第三节 眼柄摘除和RNAi对卵黄蛋白原基因表达及性腺发育的影响

1 材料与方法

2 实验方法

3 结果

4．讨论

第三章 青虾卵黄蛋白原受体基因的克隆、表达和功能研究

第一节 青虾卵黄蛋白原受体基因的克隆和序列分析

1 实验材料

2 实验方法

3．结果与分析

4．讨论

第二节 青虾卵黄蛋白原受体基因的时空表达分析

1 实验材料

2 实验方法

3．结果与分析

4 讨论

第三节 眼柄摘除和RNAi对卵黄蛋白原受体的影响

1 材料与方法

2 实验方法

3 结果

4 讨论

全文结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文及专利