拟南芥核输入载体与黄素含量分别对抗病性与开花时间的调控作用

摘要

植物生长发育过程中时刻面临着的外界环境变化所带来的威胁，为了生命得以延续，植物进化出了多种机制用以应对来自生物和非生物的胁迫。准确而快速的调控大量防卫反应基因的表达是植物应对威胁的关键步骤之一。其中转录因子介导的防卫基因表达在这一过程中起到了举足轻重的作用。当蛋白分子≥40KD时，它们必须与载体分子结合后才能通过核孔复合体进出细胞核，因此转录因子的核质转运成为植物防卫反应信号传导的一个重要环节。
　　开花对于被子植物来说是其整个生命过程中最为重要的环节。拟南芥开花调控受到多种途径调节，包括光周期途径、赤霉素途径、春化途径和自主途径等。已有研究表明，异源表达海龟核黄素结合蛋白(RfBP)的拟南芥中茎尖开花调控基因FD和花分生组织特征基因AP1的表达明显提高，诱导拟南芥提早开花。
　　1、抗病性相关的拟南芥核输入载体蛋白突变体的筛选
　　在真核生物中，核质转运能够对信号传导进行精确的调控，也是控制植物防卫信号传导的重要途径。植物对外源病原物的抵抗过程中，有许多蛋白质会参与其中，特别是转录因子。转录因子在核糖体合成之后必须进入细胞核才能行使功能，因此转录因子的核质转运成为植物防卫反应的关键过程。现有研究表明，核质转运过程中的关键组分核输入载体蛋白和核孔蛋白，均参与了拟南芥系统获得性抗病(SAR)和抗病基因介导的防卫反应过程，说明了核输入载体蛋白和核孔蛋白对植物抗病起到了重要作用。本实验室，从拟南芥种质资源中心(ArabidopsisBiological Resource Center)获得了T-DNA插入到21个核输入载体基因的99种突变体。随后，对所有突变体种子进行了抗性筛选以及PCR验证纯合体的工作。在得到78种纯合体之后，用丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)毒性菌株DC3000(Pst DC3000)和胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovora subsp.carotovora)菌株RL4(Pcc RL4)测定抗病性。抗病性统计的结果显示，有7种突变体对两种病原菌处理均感病，3种突变体均抗病，分别属于7种核输入载体基因。综合已有的研究以及我们的试验结果，我们发现其中有一个基因编码了有胚植物所特有的核输入载体(importinβ)，该基因被命名为PLANTKAP。
　　2、核输入载体PLANTKAP在抗病性通路中的功能研究
　　我们通过纯合体验证得到78种纯合突变体，之后用两种病原菌对这些纯合突变体进行抗病性验证;最后得到了7种感病和3种抗病突变体植株。本章中我们选取了其中在PLANTKAP基因上突变的两种突变体plantkap-1(SLAK_119665)和plantkap-2(S ALK_023981)进行研究。在激素处理野生型拟南芥的试验中，我们发现用2 mmol/L SA处理后，PLANTKAP表达量比对照处理上调30倍左右。之后我们用病原菌Pst DC3000处理突变体，检测水杨酸通路的标志基因PR1与PR2的表达情况，qRT-PCR的结果显示突变体中PR1和PR2的表达量比野生型降低了6～10倍。然后通过在洋葱表皮细胞和拟南芥叶片中瞬时表达观察PLANTKAP的亚细胞定位，发现PLANTKAP主要定位于细胞核内。NPR1和TGA2是水杨酸信号通路中关键的转录因子，突变体和野生型中NPR1与TGA2的表达没有差异。通过亚细胞定位观察发现NPR1在突变中的细胞定位发生改变，但TGA2的定位不受影响。酵母双杂交实验发现PLANTKAP与NPR1之间不存在直接的互作。
　　3、核黄素受体蛋白调控拟南芥开花时间的信号机制
　　核黄素受体蛋白在体内能够与游离态黄素结合，降低生物体内游离态黄素的含量。本实验室最近研究表明，在转基因异源表达海龟核黄素结合蛋白(RfBP)的拟南芥叶片细胞内H2O2浓度的增加，提高了茎尖开花调控基因FD和花分生组织特征基因AP1的表达，并诱导提早开花。与此同时，表达了RfBP的拟南芥(RfBP+)的线粒体电子传递链(METC)中的19个基因有13个基因的表达量比野生型下降了2～3倍。因此拟南芥RfBP+细胞内H2O2浓度的增加可能来自于电子传递链，这是由于鱼藤酮诱导电子传递链发生电子泄露也会造成类似的作用。当拟南芥RfBP+中的RfBP基因被沉默后，METC中被抑制的基因恢复表达，拟南芥早花表型也消失，同时FD和AP1基因的表达水平、H2O2浓度以及黄素含量也都恢复到了野生型水平。拟南芥RfBP+喷施外源核黄素后开花推迟5～6 d，FD和AP1基因的表达和黄素含量也恢复到野生型水平，但H2O2浓度的仅降低了55％;外源H2O2处理造成拟南芥提早开花，加入H2O2清除剂后开花时间恢复正常。植物组织内不同来源的H2O2均会促进拟南芥提前开花，但只有RfBP+会对METC的表达产生抑制作用。

目录

声明

摘要

缩略语

前言

上篇 文献综述

第一章 核质转运的分子机制

一、核输入载体

二、核孔复合体

三、Ran和RanGTP梯度

四、核质转运机制

五、核质转运在植物防卫中的作用

第二章 植物激素与防卫反应关系概述

一、水杨酸信号通路

二、茉莉酸信号通路

三、乙烯信号通路

四、信号通路间的交叉调控

第三章 拟南芥NPRl及NPR1-like的研究进展

一、NPR1的发现

二、NPR在植物防卫中的作用

第四章 拟南芥开花调控研究进展

一、拟南芥的开花调控途径

二、开花调控途径的整合

下篇 研究报告

第一章 抗病性相关的拟南芥核输入载体突变体的筛选

1 材料与方法

2 结果与分析

讨论

第二章 核输入载体PLANTKAP在抗病性通路中的功能研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 核黄素受体蛋白调控拟南芥开花时间的信号机制

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

全文总结及主要创新点

参考文献

攻读博士学位期间论文发表

致谢