调控北京鸭和番鸭抗热应激关键基因的筛选与鉴定

摘要

随着畜牧业集约化和产业化的发展，养殖者都力求在最小的空间内饲养更多的畜禽，导致养殖密度越来越大，尽管可以最大限度的提高畜禽的生产性能，降低劳动成本，增加经济效益，但也容易带来一些外在的不良因素，从而影响畜禽的生长发育以及饲料报酬，最终引起畜禽产生疾病或死亡，给养殖者造成巨大的经济损失。这些因素包括高温、缺氧、高压、紫外线、组织感染、重金属等，其中高温环境带来的不良影响尤其显著。当外界环境温度在畜禽的舒适区温度范围时，动物就能正常生产，发挥良好的繁殖性能;当外界温度与舒适区温度不适应时，导致畜禽的生产性能等受到严重的影响，造成较大的经济损失。
　　本试验以较多在中国北方饲养的北京鸭和主要在南方饲养的番鸭为研究对象，重点研究了急性热应激对鸭肝脏功能代谢的影响。通过组织形态学观察和抗氧化指标的测定研究了热应激对鸭肝脏组织损伤及氧化功能的影响;通过荧光定量PCR研究了热应激状态下鸭肝脏热休克蛋白及炎性因子相关基因的表达水平;采用二代转录组测序RNA-Seq的方法分析了热应激前后番鸭肝脏组织中差异表达的基因情况;利用体外培养的方法，研究了HSP70-siRNA对鸭肝细胞细胞凋亡信号通路关键基因表达的影响;运用了蛋白质组学的方法，研究了热应激对北京鸭和番鸭肝脏组织蛋白表达的影响;同时，我们还根据蛋白质组学的结果，克隆了部分与热应激相关的基因，分析了两个鸭种间的序列结构差异。
　　1.急性热应激对北京鸭和番鸭肝脏组织抗氧化系统、炎性因子及热休克蛋白的影响
　　热应激严重影响家鸭存活率、产蛋率及肉质性能。本试验旨在研究急性热应激对北京鸭和番鸭肝脏组织病理损伤、抗氧化酶活性(SOD、MDA、CAT、T-AOC)、炎性因子及热休克蛋白的影响。鸭被暴露于39±0.5℃下1h，然后迅速转入20℃中恢复1h和3h，迅速采集各温度下的鸭肝脏组织用于后续分析。结果显示，热应激导致北京鸭和番鸭都出现不同程度的组织损伤，但北京鸭肝脏损伤情况更加严重;热应激1h后，番鸭肝脏组织抗氧化酶(SOD、MDA、CAT、T-AOC)活性均出现上调，而北京鸭则下调，恢复期鸭肝脏组织抗氧化酶活性均下调;与对照组相比，热应激后鸭肝脏组织中HSP70，HSP60，HSP40基因表达水平均出现上调的现象;番鸭肝脏组织中HSP10基因表达上调，北京鸭则无明显变化;相反地，应激组HSP90基因表达水平在均显著下降。热应激状态下，番鸭iNOS基因水平有明显的上升，北京鸭则有明显的下降;COX-2基因表达水平在鸭肝脏组织中均出现上调的现象。综上所述，急性热应激能够影响北京鸭和番鸭肝脏组织形态学特征，导致其抗氧化机能发生改变，并显著影响鸭肝脏组织内HSP基因与相关炎性因子的表达水平。与北京鸭相比，番鸭具有更强的热应激抵抗能力。
　　2.热应激番鸭肝脏组织转录组分析
　　在本试验中，运用Illumina高通量测序技术分析了番鸭在热应激后肝脏组织中转录组水平上所有基因表达水平的情况。结果显示:de novo测序总共获得超过225，000，000个原始reads，对应产生22.75 Gb数据。从头拼接组装后，产生36，903个Unigenes，平均长度为1，135bp，其中21，221(57.50％)个Unigenes有注释。对有注释的Unigenes进行GO分析发现，富集最多的是转录、信号转导及凋亡通路。同时，我们对热应激组及对照组数据比较分析发现，共产生470个差异表达的基因，240个基因表达上调，230个基因表达下调。GO富集分析显示这些基因主要与蛋白质折叠及伴侣绑定有关;KEGG通路分析发现，番鸭热应激后，Ras和MAPKs信号通路被激活。同时，我们对主要的几个基因进行了实时荧光定量PCR验证。本研究丰富了番鸭基因组的序列信息，对研究鸭在抗热应激中的反应提供了新的视角，分析得到的相关差异基因可以作为今后的候选基因，为培育鸭耐热品系提供理论数据。
　　3.抑制HSP70基因表达对鸭肝脏细胞凋亡相关基因表达的影响
　　研究表明，在不良刺激影响下，HSP自身可以调控细胞的凋亡。本试验利用鸭肝细胞体外培养的方法，研究HSP70-siRNA对鸭肝脏细胞内细胞凋亡信号通路关键基因表达的影响。试验采用常用的二步灌流分离法，得到了活力较高的鸭肝脏细胞，随后进行HSP70基因干扰试验。结果表明，HSP70-siRNA处理细胞CCO基因表达水平提高1156.7％（P＜0.01）、SAPK基因表达水平提高733.3％(P＜0.01)、p38MAPK基因表达量降低70.0％（P＜0.01）、RASA1基因表达量降低83.4％(P＜0.01)。
　　4.急性热应激前后北京鸭与番鸭肝脏蛋白质代谢的研究
　　本试验运用蛋白组学的方法，研究北京鸭与番鸭中与耐热相关的蛋白。鸭被暴露于39±0.5℃下1h，然后迅速转入20℃环境中恢复3h，采集各温度下的鸭肝脏组织，提取肝蛋白用于2D电泳分析。凝胶图像分析之后，共发现61个差异表达的蛋白，其中54个经MALDI TOF/TOF MS成功鉴定。在这54个蛋白中，7个蛋白共同存在于北京鸭和番鸭中，47个为单独存在（25在番鸭，22在北京鸭中）。分析这些蛋白发现，分子伴侣相关蛋白如HSP70和HSP10，在北京鸭和番鸭中都出现显著的上调。然而，本试验还发现其它的一些蛋白，例如α烯醇化酶(α-enolase)，S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase)，在北京鸭和番鸭中呈相反地表达趋势。根据GO富集分析显示，差异表达的蛋白主要富集在细胞死亡与凋亡(20.93％)、氨基酸代谢(13.95％)和氧化还原(20.93％)三大类。同时，我们选取几个差异表达的蛋白所对应的基因进行了RT-PCR验证。本文第一次从蛋白组学方向研究了北京鸭和番鸭在对抗热应激时的蛋白表达差异，为今后更好的理解热应激反应机制，耐热品种的培育提供可靠的理论数据。
　　5.番鸭ENO1基因cds序列克隆及结构分析
　　温度能够影响蛋白质3D结构的稳定性，导致蛋白质的功能如配体的识别与结合等发生改变，从而使其对热敏感。因此，蛋白质氨基酸的自然进化应朝向其能在特殊的热环境中发挥良好功能的方向进行。本试验根据前面试验得到的北京鸭番鸭差异表达蛋白的数据，挑选出α-enolase(ENO1)这一蛋白，以GenBank上公布的绿头野鸭ENO1基因序列为参考，克隆番鸭ENO1基因cds序列，分析ENO1基因序列及结构的差异，探讨该基因结构的变化对北京鸭和番鸭耐热性差异可能造成的影响。结果表明，番鸭ENO1基因cds序列含有1305碱基，共编码434个氨基酸;北京鸭ENO1基因(GI213090)与番鸭ENO1基因的cds序列共存在21个碱基的差异;在蛋白序列上共存在5个氨基酸的差异。其中，北京鸭第171位和173位分别为脯氨酸(P)和半胱氨酸(C)，而番鸭分别为亮氨酸(L)和缬氨酸(V)。缬氨酸(V)为非极性氨基酸（疏水），而半胱氨酸为极性氨基酸（亲水），同时，在α-enolase三级结构中，171位和173位同时位于β折叠的最上沿，对于进入蛋白催化区域的底物具有一定的指导作用，这可能与北京鸭和番鸭耐热性的不同有关。
　　综上所述，急性热应激对北京鸭与番鸭肝脏组织均有不同程度的损伤，但比较发现，番鸭具有更好的耐热能力。肝脏组织转录组和蛋白质组学分析结果发现，北京鸭和番鸭耐热性的差异可能主要与机体内能量供应和抗氧化能力有关。本研究为鸭抗热应激的分子调控机理及分子辅助育种奠定了基础。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词(Abbreviation)

第一章 热应激及其研究进展

1 应激综述

1．1 细胞水平反应

1．2 分子水平反应

2 热休克蛋白概述

2．1 热休克蛋白的发现

2．2 热休克蛋白的分类

2．3 热休克蛋白的结构和生物学功能

第二章 转录组学和蛋白质组学的研究方法及当前进展

1 转录组学

1．1 研究转录组的基本方法

1．2 RNA-Seq研究进展

2 蛋白质组学

2．1 双向电泳技术

2．2 免疫共沉淀技术

2．3 蛋白质芯片技术

2．4 同位素标记相对和绝对定量技术

2．5 质谱和生物信息学分析

3 本研究的目的及意义

第三章 急性热应激对北京鸭和番鸭肝脏组织病理损伤及相关抗氧化活性的影响

1 材料与方法

1．1 样品采集

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

1．4 试验方法

1．5 数据统计

2 结果

2．1 热处理对北京鸭和番鸭肝脏组织结构的影响

2．2 热处理对北京鸭番鸭肝脏组织抗氧化酶活性的影响

3 讨论

第四章 热应激对北京鸭和番鸭肝脏组织热休克蛋白(HSPs)及相关炎性因子的影响

1 材料与方法

1．1 样品采集

1．2 试剂

1．3 仪器

1．4 试验方法

2 结果与分析

2．1 热应激北京鸭和番鸭肝脏组织中HSPs基因表达水平

2．2 热应激北京鸭和番鸭各组织中HSP70基因表达水平

2．3 热应激北京鸭和番鸭肝脏中相关炎性因子表达水平

3 讨论

第五章 热应激番鸭肝脏组织的差异转录组学分析

1 材料与方法

1．1 样品采集

1．2 试剂

1．3 仪器

1．4 试验方法

2 结果与分析

2．1 总RNA提取结果

2．2 组装结果分析

2．3 拼接转录本的注释

2．4 拼接转录本的GO功能及KEGG通路分析

2．5 差异基因的筛选及分析

2．5 差异基因的qRCR验证

2．6 SSR简单序列重复标记

3 讨论

3．1 转录组文库构建及拼接序列的注释情况

3．2 差异基因的分析

3．3 SSR简单序列重复标记

4 小结

第六章 抑制HSP70基因表达对鸭肝脏细胞凋亡相关基因表达的影响

1 材料与方法

1．1 样品采集

1．2 试剂及主要溶液配制

1．3 仪器

1．4 试验方法

2 结果

2．1 鸭肝脏原代细胞培养

2．2 鸭原代肝细胞生长曲线

2．3 HSP70-siRNA干扰引物筛选与优化

2．4 HSP70对细胞凋亡通路关键基因表达的影响

3 讨论

第七章 热应激条件下北京鸭和番鸭肝脏蛋白质代谢的研究

1 材料与方法

1．1 样品采集

1．2 试剂

1．3 仪器

1．4 试验方法

2 结果

2．1 北京鸭与番鸭热应激前后差异表达蛋白的鉴定

2．2 北京鸭与番鸭热应激及恢复期间比较蛋白组学分析

2．3 差异蛋白的信息学分析

2．4 差异表达蛋白的转录水平验证

3 讨论

3．1 氧化应激蛋白

3．2 信号通路相关蛋白

3．3 能量代谢相关蛋白

3．4 氨基酸和蛋白质代谢相关蛋白

4 结论

第八章 番鸭ENO1基因cds序列克隆及结构分析

1 材料与方法

1．1 样品采集

1．2 试剂

1．3 仪器

1．4 试验方法

2 结果

2．1 番鸭ENO1基因克隆测序结果分析

2．2 北京鸭与番鸭ENO1基因结构分析

2．3 北京鸭与番鸭α-enolase三级结构比较

3 讨论

参考文献

全文结论

创新点

附录

攻读博士期间发表及待发表的论文

致谢