狭叶香蒲响应镉胁迫miRNAs的鉴定及其表达特征分析

摘要

狭叶香蒲(Typha angustifolia)为香蒲科香蒲属水生观赏植物，不仅可美化水体，还具有较强的吸附重金属的能力，可作为优良的生态修复植物用于污染水体的净化，是人工湿地建设常用的植物。我们的研究表明，狭叶香蒲具有较强的耐镉性，但对其响应镉胁迫的分子机理研究较少。近年来新发现microRNAs(miRNAs)在调控植物对重金属胁迫适应性中发挥着重要作用。但目前对于狭叶香蒲响应镉胁迫诱导表达的miRNA及其调控机理尚未见报道。为进一步了解狭叶香蒲在镉胁迫下miRNA的诱导表达情况，本研究以狭叶香蒲幼苗为试材，在水培条件下进行镉胁迫处理，通过进行转录组及miRNA的高通量测序，用生物信息学方法分析鉴定出响应镉胁迫差异表达的miRNA，并预测其靶基因，另外分析了不同组织器官内、不同时间miRNA的表达情况。本研究结果可丰富狭叶香蒲耐镉分子机理的理论，为将狭叶香蒲用于生态修复提供科学依据。主要的研究结果如下:
　　1.狭叶香蒲响应镉胁迫的生理反应
　　以狭叶香蒲幼苗为试验材料，在水培条件下设置不同浓度的镉胁迫处理，通过测定不同浓度镉处理下狭叶香蒲的生长量、叶绿素含量、MDA含量、相对电导率以及根尖的希夫试剂染色情况，证明了狭叶香蒲对镉的耐性，同时筛选出用于高通量测序的适宜镉浓度为250μM，该浓度下狭叶香蒲既表现出胁迫伤害又不会致死，是后续试验理想的镉浓度。
　　2.狭叶香蒲转录组和小RNA文库高通量测序结果
　　分别在镉胁迫处理不同时间，对狭叶香蒲根、叶鞘、叶等不同器官取样，分别提取镉胁迫处理和对照样品的总RNA，通过混样，分别建立1个转录组文库和2个小RNA(sRNAs)文库，并进行高通量测序。从获得的一个转录组cDNA文库中读取了57608230的原始数据，对DNA序列组装和分析产生Unigene102473个，作为后续miRNA预测靶基因的依据。
　　在转录组数据的基础上，归纳分析了测序得到的sRNAs，发现有114个已知的保守miRNAs乖41个预测的miRNAs在两个小RNA文库中均有表达。通过生物信息学分析，得到了89个保守miRNAs和21个预测miRNAs的764个靶基因。对测序数据统计分析并进行试验验证，结果表明4个保守的miRNAs和6个预测的miRNAs在镉处理前后表达差异显著。对这10个miRNA进行qRT-PCR验证，结果表明这些miRNA的表达量与sRNA转录组的数据严格吻合;同时分析这些miRNA对应靶基因的的表达量，发现靶基因的表达量是受miRNA介导的，这表明，本研究的转录组与sRNA测序数据是可靠的，可用于研究镉胁迫诱导的狭叶香蒲miRNA的变化。结合靶基因的功能，这些结果证明了miRNAs可能在狭叶香蒲响应镉胁迫过程中起到了一定的作用。
　　3.镉胁迫诱导表达的miRNA的时空表达特征
　　从10个差异表达的miRNA中选取4个差异表达极显著的miRNA，利用qRT-PCR分别检测验证它们及其靶基因在狭叶香蒲镉处理后不同时间点不同组织的相对表达量，揭示其时空表达特性，探讨它们在狭叶香蒲镉胁迫中起到的作用。结果表明，4个miRNA在狭叶香蒲根、叶鞘和叶中均有不同程度的表达。表现为:镉胁迫下，筛选的2个miRNA(novel_mir_10、novel_mir_18)在根、叶鞘和叶中均有不同程度的上调，并且表达特征相似;另2个miRNA(novel_mir_25、novel_mir_30)在根、叶鞘和叶中表达量下调。它们对应的5个靶基因的表达趋势与miRNAs的表达趋势相反。novel_ mir_10的靶基因CL7951.Contig1_cattail和novel_mir_18的靶基因CL354.Contig1_cattail在镉处理后，在狭叶香蒲根、叶鞘和叶中均显示了不同程度的下调，且novel_mir_25的靶基因CL3870.Contig2_cattail和Unigene23735_cattail在根中表达量上调，在叶和叶鞘中表达水平趋于稳定，与对照相比无显著差异。novel_mir_30的靶基因Unigene11164_cattail在根、叶鞘和叶中表达量上调。这一结果验证了高通量测序的准确性，并且符合miRNA对靶基因的负调控特征，证明了这些miRNA和它们的靶基因在狭叶香蒲响应镉胁迫过程中发挥着重要作用。

目录

声明

摘要

缩略词

引言

第一章 文献综述

1．镉对植物的影响

1．1 镉污染的现状及危害

1．2 镉在植物体内的分布及毒害作用

1．3 植物耐镉机制

2 miRNA在植物逆境中的调控作用

2．1 miRNA的简介

2．2 植物miRNA在调控非生物胁迫中的作用

3．狭叶香蒲净化水体的研究

3．1 狭叶香蒲概述

3．2 狭叶香蒲吸收重金属、净化水体的研究进展

第二章 狭叶香蒲响应镉胁迫的生理反应

第一节 不同浓度镉处理对狭叶香蒲生长及某些生理指标的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 镉胁迫下狭叶香蒲相对电导率和MDA的动态变化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 狭叶香蒲响应镉胁迫的转录组与sRNA高通量测序分析

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 试验处理

1．3 总RNA提取方法

1．4 高通量测序

2 结果与分析

2．1 狭叶香蒲总RNA的提取结果

2．2 狭叶香蒲转录组测序和注释分析

2．3 小RNA的高通量测序情况分析

2．5 狭叶香蒲特有的miRNA的鉴定

2．6 isomiRNA的鉴定

2．7 狭叶香蒲miRNA靶基因的预测

2．8 对照与镉胁迫下狭叶香蒲miRNA表达的差异

2．9 镉胁迫下差异表达的miRNA及其靶基因表达量与表达方式的验证

3 讨论

3．1 狭叶香蒲转录组的特点

3．2 狭叶香蒲中保守的和新的miRNA

3．3 狭叶香蒲响应镉胁迫的miRNA及其靶基因

第四章 狭叶香蒲响应镉胁迫的miRNA及其靶基因的时空表达特性

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 试验方法

1．3 数据统计与分析

2 结果与分析

2．1 novel_mir_10及其靶基因的时空表达特征

2．2 novel_mir-18及其靶基因的时空表达特征

2．3 novel_mir_25及其靶基因的时空表达特征

2．4 novel_mir_30及其靶基因的时空表达特征

3．讨论

全文结论

硕士期间发表文章情况

参考文献

致谢

附录