大豆不育系NJCMS1A与保持系NJCMS1B的DNA甲基化比较分析及候选基因的克隆

摘要

作物杂种优势利用是提高产量的一条有效途径，质核互作雄性不育在杂种优势利用中具有重要作用。尽管诸多学者对大豆质核互作雄性不育开展了广泛研究，但其分子机理仍不清楚。关于DNA甲基化与质核互作雄性不育的关系在水稻等作物上已有报道，但在大豆上尚未有相关报道，因此本研究拟开展大豆不育系NJCMS1A与其保持系NJCMS1B的DNA甲基化比较分析及候选基因的克隆，获得主要结果如下:
　　1、利用MeDIP-seq技术分别检测了大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A与其保持系NJCMS1B的全基因组DNA甲基化。MeDIP-seq测序显示clean reads在染色体上的分布比较均匀，可覆盖大豆基因组中绝大多数的CpGs，主要分布于转座元件、启动子、内含子等基因组元件。DNA甲基化图谱分析显示，NJCMS1A与NJCMS1B的DNA甲基化图谱相似，其中转录起始位点(TSS)和转录终止位点(TTS)附近的甲基化水平最低，当远离上述两个位点时甲基化水平骤然上升，而且基因体的甲基化水平要高于TSS上游2kb和TTS下游2kb区域。不同基因组元件中的甲基化峰分布表明，转座元件中的甲基化峰数目最多，而5'UTR、3'UTR和编码序列(CDS)中的甲基化峰数目较少，转座元件中又以长末端重复(LTR)和末端反向重复(TIR)发生甲基化的数目最多。NJCMS1A与NJCMS1B间共鉴定出178个差异甲基化基因，其中156个表现下调、22个表现上调（以NJCMS1B为对照）。GO功能分析表明，114个差异甲基化基因注释到一个或多个GO类别，其中有4个GO term为显著富集;KEGG代谢通路分析表明，18个差异甲基化基因参与并富集于同源重组、嘌呤代谢、蛋白酶体、非同源末端连接、嘧啶代谢等通路。此外，利用重亚硫酸盐测序技术对8个差异甲基化区域进行了验证，发现有6个差异甲基化区域的DNA甲基化模式与MeDIP-seq结果一致，说明MeDIP-seq测序结果是可靠的。
　　2、综合MeDIP-seq结果和前期的转录组数据，筛选出GmGST12和GmIscU1-like两个候选基因进行了克隆和表达分析。从NJCMS1A和NJCMS1B的花蕾中克隆了GmGST12和GmIscU1-like基因，其ORF分别为708 bp和516bp。生物信息学分析表明，GmGST12和GmIscU1-like分别编码谷胱甘肽S-转移酶(GST)和铁硫簇支架蛋白，GmGST12具有GST_N和SCOP两个保守结构域，GmIscU1-like具有一个IscU_like保守结构域。系统进化树分析发现，GmGST12和GmIscU1-like分别与辣椒CcGST12和蒺藜苜蓿MtISU1的同源性最高，氨基酸序列一致性分别为53％和83.72％。组织表达分析表明，GmGST12在NJCMS1A花蕾中的表达水平显著地高于NJCMS1B，而在根、茎、叶中的表达没有差异，GmIscU1-like在NJCMS1A的根、茎和花蕾中的表达水平均显著地高于NJCMS1B，而在叶中的表达水平却显著地低于NJCMS1B。亚细胞定位结果表明GmGST12定位于全细胞。构建了植物过表达载体pCAMBIA3301-GFP-GmGST12和pCAMBIA3301-GFP-GmIscU1-like，并成功转化了根癌农杆菌，为转基因功能验证研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 植物雄性不育现象和杂种优势利用

2 植物雄性不育的研究进展

2．1 植物雄性不育的概念

2．2 植物雄性不育的类型

2．3 植物雄性不育的机理

3 DNA甲基化的研究进展

3．1 表观遗传学概述

3．2 DNA甲基化的作用

3．3 DNA甲基化的检测方法

3．4 DNA甲基化与植物雄性不育

4 大豆雄性不育的研究进展

4．1 大豆细胞核雄性不育的研究进展

4．2 大豆质核互作雄性不育的研究进展

4．3 大豆雄性不育的应用

5 本研究的目的和意义

第二章 大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A与其保持系NJCMS1B的全基因组DNA甲基化比较分析

1 材料和方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 全基因组DNA甲基化分析

2．2 重亚硫酸盐测序验证

2．3 甲基化图谱分析

2．4 甲基化峰分布

2．5 NJCMS1A和NJCMS1B间的差异甲基化区域和基因

2．6 差异甲基化基因的GO功能和KEGG代谢通路分析

3 讨论

3．1 与碳水化合物代谢相关的基因

3．2 与转录调控相关的基因

3．3 与花粉壁发育相关的基因

3．4 与雄配子发育相关的基因

3．5 与线粒体结构相关的基因

第三章 大豆GmGST 12的克隆及表达分析

1 材料和方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 总RNA的提取和cDNA的合成

2．2 GmGST 12基因的全长cDNA克隆

2．3 GmGST 12基因的生物信息学分析

2．4 GmGST 12的组织表达分析

2．5 GmGST 12的亚细胞定位

2．6 GmGST 12植物过表达载体的构建

3 讨论

第四章 大豆GmIscU1-like的克隆及表达分析

1 材料和方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 总RNA的提取和cDNA的合成

2．2 GmIscU1-like基因的全长cDNA克隆

2．3 GmIscU1-like基因的生物信息学分析

2．4 GmIscU1-like的组织表达分析

2．5 GmIscU1-like的亚细胞定位

2．6 GmIscU1-like植物过表达载体的构建

3 讨论

全文结论与创新之处

参考文献

附录

致谢