五种水果作物果实成熟过程中乙烯合成及应答途径相关基因的功能分析

摘要

乙烯是调控植物生长发育、成熟衰老的重要内源激素。从种子萌发到开花、性别分化以及果实成熟等都有乙烯的参与。乙烯在植物中生物学效应的发挥主要通过两个方面来实现:乙烯生物合成和乙烯信号转导。基因工程调控果实乙烯合成相关基因可有效地抑制果实的乙烯合成，进而调控果实的成熟进程，乙烯信号转导途径被认为是实现乙烯在植物体内功能的主要途径。因此在乙烯合成机制的研究基础上，延伸研究乙烯信号转导途径在果实成熟衰老进程中的作用机制，可为进一步调控果实成熟衰老提供新的科学依据。
　　利用生物信息学工具，以拟南芥乙烯生物合成和信号转导途径相关基因的序列为探针，对非呼吸跃变型（葡萄和草莓）和呼吸跃变型（苹果、桃和梨）果实乙烯合成与信号转导途径相关基因进行预测，并对预测到的基因进行验证和表达分析。在葡萄、草莓、苹果、梨和桃果实中分别验证到了23、23、18、27和16个乙烯生物合成和信号转导途径相关基因。结果表明，非跃变型果实和跃变型果实都存在相应的乙烯生物合成和信号转导途径相关基因，但基因数目的不同，以及它们在果实发育过程中表达水平的不同变化可能是导致这两类果树在对乙烯响应方面存在区别的原因。此外，相同基因家族的不同成员可能受发育阶段影响，或特异参与果实成熟衰老过程。根据检索到的EST序列在植物组织中的分布来看，桃相关基因在果实中的表达水平可能要高于葡萄和苹果。
　　通过对VvACO1和PpACO1的氨基酸序列进行比对共发现53个氨基酸的变化，其中包括32个同类型氨基酸变化和21个不同类型的氨基酸变化。为进一步研究这些氨基酸的变化是否决定了基因编码蛋白功能的不同与否，我们利用瞬时表达的方法对VvACO1和PpACO1在番茄果实中进行了瞬时表达研究，结果表明，VvACO1和PpACO1在番茄果实中的超表达，能够增加ACO1基因的表达量，并促使果实提前成熟。而PpACO1基因诱导果实成熟的效应较VvACO1显著。VvACO1和PpACO1的基因沉默可以干扰番茄果实中LeACO1基因的表达，从而延迟成熟。同时对乙烯信号转导下游元件VvERF和PpEIN3进行瞬时表达研究表明，VvERF和PpEIN3的超表达能够使LeACO1基因在超表达植株中表达上调。VvERF和PpEIN3基因沉默后LeERF和LeEIN3基因的表达量大大降低，果实延迟成熟。VvERF和PpEIN3在葡萄和桃果实的成熟过程中表达水平不断上升，说明它们参与果实的生长发育。
　　为了进一步研究非跃变型果实中，乙烯等相关激素在果实成熟进程中的作用，我们利用转录组测序技术从全基因组水平对‘藤稔’葡萄在第一生长周期（花后40天）、转色期（花后65天）和成熟期（花后90天）中果实发育相关重要差异基因的表达与分子调控机制进行了研究。结果表明每个发育时期的样本，能够比对到参考序列上的总reads条数都在64％以上。DAF65与DAF40果实相比差异表达基因数目为5，620，上调957个，下调的是4，663个。DAF90与DAF40果实相比差异基因总数为5，196，其中上调1，340个，下调3，856个。DAF90与DAF65果实相比差异基因总数为3，381个，其中上调2，035个，下调的是1，346个。对差异表达的基因进行GO分析和Pathway分析，发现葡萄果实发育涉及到8种激素，其中生长素信号转导途径相关的差异表达基因所占比例最高，其次是脱落酸、茉莉酸和乙烯。进一步对八种激素合成及信号转导网络分析，发现绝大部分参与激素代谢的基因在葡萄果实第一生长周期表达量较高，而在转色期表达量最低。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 乙烯的生物合成与信号转导

1．1 乙烯的生物合成及其相关基因研究

1．2 乙烯的信号转导途径及其相关基因研究

1．3 乙烯与果实成熟衰老

2 瞬时表达技术的研究

2．1 农杆菌介导的瞬时表达技术

2．2 病毒诱导的基因沉默技术

3 植物果实生长发育的转录组学研究进展

3．1 RNA-Seq技术简介及其优势

3．2 RNA-Seq技术在果实发育研究中的应用

4 本研究的目的意义

第二章 葡萄、草莓、苹果、梨和桃乙烯生物合成及信号转导途径的生物信息学预测及验证

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 葡萄、草莓、苹果、梨和桃与乙烯生物合成相关基因的生物信息学预测

2．2 葡萄、草莓、苹果、梨和桃与乙烯信号转导途径相关基因的生物信息学预测

2．3 葡萄和苹果乙烯生物合成与信号转导途径相关基因EST序列的组织特异性分布

2．4 葡萄、草莓、苹果、梨和桃乙烯生物合成与信号转导途径相关基因的染色体定位和系统发生树分析

2．5 葡萄、草莓、苹果、梨和桃乙烯生物合成与信号转导途径相关基因的表达分析

3 讨论

第三章 葡萄和桃乙烯合成及信号转导途径相关基因在番茄果实中的瞬时表达分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 VvACO1和PpACO1的氨基酸序列分析

2．2 VvACO1和PpACO1的组织特异性表达

2．3 VvERF和PpEIN3的组织特异性表达

2．4 载体的构建

2．5 VvACO1和PpACO1在番茄果实中的超表达

2．6 VvACO1和PpACO1在番茄果实中的干扰

2．7 VvERF和PpEIN3在番茄果实中的超表达

2．8 VvERF和PpEIN3在番茄果实中的干扰

3 讨论

第四章 ‘藤稔’葡萄果实成熟过程中乙烯等激素相关基因的分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 测序质量评估

2．2 乙烯等植物激素代谢相关基因在‘藤稔’果实发育过程中的研究

2．3 qRT-PCR验证基因表达

3 讨论

全文结论

本文创新点

参考文献

附表

攻读学位期间已发表或接收的论文

致谢