基于化学振荡的酶联免疫方法检测胰岛素

摘要

胰岛素可以通过其免疫特异性，与被碱性磷酸酶标记的抗体结合成免疫复合物，发生酶联免疫反应，碱性磷酸酶是一种水解酶，它可以催化磷酸单酯类化合物进行水解，而磷酸单酯水解产物又可以被化学振荡检测。本论文的设计思路可以通过找到一种本身对化学振荡没有影响，但是其碱性磷酸酶催化的水解产物却可以直接扰动化学振荡，碱性磷酸酶又可以发生酶联免疫反应，所以用化学振荡去检测酶联免疫的生成物。
　　本论文提出建立一种新型的微量的B-Z振荡体系来检测酶联免疫分析中的胰岛素浓度。不同浓度的胰岛素与被碱性磷酸酶标记的抗体进行酶联免疫反应，利用此免疫生成物上的碱性磷酸酶，催化一定浓度的维生素C磷酸酯钠溶液发生水解反应，反应生成的维生素C可以直接用新型的微量的B-Z振荡体系进行测定，在特定条件下，不同浓度的碱性磷酸酶催化生成的维生素C的量不同，从而引起微量的B-Z振荡体系的振幅或周期的改变量不同，根据化学振荡的这种参数的改变量就可以对酶联免疫反应中的胰岛素进行浓度测定。
　　建立一种新型的微量的苹果酸体系的B-Z化学振荡，通过实验对其微量体系中的各组分浓度进行优化。结果表明，当这种微量的苹果酸体系的B-Z化学振荡的个组分浓度为：[H2SO4]=1.05mol/L，[NaBrO3]=0.60 mol/L,[[CuL](ClO4)2]=2.21*10-3mol/L，[DL-苹果酸]=0.6mol/L时，维生素C对体系的扰动最大。当维生素C的浓度在0.5*10-9～1*10-7mol/L范围内，此振荡周期的该变量与log[VC]呈良好的线性关系，检出限为3.15*10-10mol/L(3δ)，最低检测量为7.875*10-17mol；加入维生素C后第一个电极电势的最高值与log[VC]呈良好的线性关系，检出限为3.95*10-10mol/L(3δ)，最低检测量为9.875*10-17mol。微量苹果酸体系的B-Z化学振荡对碱性磷酸酶的测定：当碱性磷酸酶的活度在1～16U/L范围内时，振荡振幅的该变量与log[ALP]呈良好的线性关系，检出限为0.59U/L(3δ)，最低检测量为1.475*10-7U；振荡周期的该变量与log[ALP]也呈线性关系，检出限为0.56U/L(3δ)，最低检测量为1.40*10-7U。
　　建立一种新型的微量的葡萄糖-丙酮体系的B-Z化学振荡检测体系，并且对其组分的各浓度进行优化。结果表明，当体系中各组分的浓度分别为：[H2SO4]=1.05mol/L，[葡萄糖]=0.06mol/L，[丙酮]=0.65mol/L，[[CuL](ClO4)2]=0.05mol/L，[NaBrO3]=0.08mol/L，维生素C对振荡的扰动最大。当维生素C的浓度在0.5*10-9～1*10-7mol/L范围内时,振荡振幅的该变量与log[VC]呈良好的线性关系，最低检测限为2.6*10-10mol/L(3δ)，最低检测量为6.5*10-16mol；振荡周期的该变量与log[VC]呈良好的线性关系与，最低检测限为2.7*10-10mol/L，最低检测量为6.75*10-17mol。用微量葡萄糖-丙酮体系的B-Z化学振荡对碱性磷酸酶进行定量分析，当酶活度在1～32U/L时，振荡振幅的该变量与log[ALP]呈良好的线性关系，最低检测限为0.57U/L，最低检测量为1.425*10-7U。
　　将不同浓度的胰岛素与被碱性磷酸酶标记的抗体直接进行酶联免疫反应，用上述两种微量的B-Z振荡体系对其进行定量分析，最后实现对胰岛素的测定。结果表明，当胰岛素在0.5*10-9～1*10-7g/L范围内时，用苹果酸体系的微量B-Z化学振荡对胰岛素进项检测，振荡振幅的该变量与log[ISN]呈良好的线性关系，最低检测限为2.35*10-10gl/L(3δ)，最低检测量为5.875*10-17g；用葡萄糖-丙酮体系的B-Z化学振荡检测时，振荡振幅的该变量与log[ISN]呈良好的线性关系，最低检测限为1.85*10-10g/L(3δ)，最低检测量为4.625*10-17g。
　　不同浓度的胰岛素通过亲和素-生物素与被碱性磷酸酶标记抗体的进行酶联免疫反应，通过这两种微量的B-Z化学振荡对其免疫生物进行测定，实现对胰岛素的定量检测。结果表明，当胰岛素在0.5*10-9～1*10-7g/L范围内时，用苹果酸体系的B-Z化学振荡检测胰岛素时，振荡振幅的该变量与log[ISN]呈良好的线性关系，最低检测限为2.00*10-10g/L(3δ)，最低检测量为5.0*10-17g；用葡萄糖-丙酮体系的B-Z化学振荡检测胰岛素时，振荡振幅的改变量与log[ISN]呈良好的线性关系，最低检测限为1.90*10-10g/L(3δ)，最低检测量为4.75*10-17g。
　　本论文的意义，首先是建立了两种不同体系的微量（总体积为1ml）B-Z化学振荡，这样就比常量将常量(总体积为40ml)的B-Z振荡检测的灵敏度提高了40倍，这就为微量物质的检测扩展了范围；其次，本论文采用微量的B-Z化学振荡对酶联免疫分析中胰岛素进行定量分析，形成一种新的检测免疫产物的方法，这将为酶联免疫分析技术注入了一股新的力量；最后，这种新型的酶联免疫检测方法不仅可以对胰岛素的浓度进行，而且为其它抗原抗体的测定方法扩展了研究领域。

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第一章 绪论

1 .1 胰岛素的定量检测方法的研究进展

1 .2 酶联免疫底物生成物的定量检测的研究进展

1 .3 B-Z化学振荡检测体系研究进展

第二章 酶联免疫分析产物检测体系的建立以及条件的优化

2 . 1 B-Z化学振荡体系催化剂[ Cu L]( Cl O4 )2的合成

2 .2 微量-苹果酸体系B-Z化学振荡建立以及条件的优化

2 .3 本章小结

第三章 微量的B-Z化学振荡间接扰动法测定碱性磷酸酶

3 .1 实验部分

3.2 实验结果与讨论

3 .3 本章小结

第四章 建立基于微量化学振荡的酶联免疫方法检测胰岛素

4 .1 实验部分

4 .2 实验结果与讨论

4 .3 本章小结

第五章 总结

5 .1 两种新型的微量B-Z化学振荡体系的建立以及条件的优化

5 .1 基于化学振荡检测体系的酶联免疫对胰岛素的检测

5 .3 今后进一步的研究方向

参考文献

个人简历 在读期间发表的学术论文

致谢