利用近等基因系对水稻抽穗期QTL-DTH3b的精细定位及长芒基因Awn3的克隆

摘要

本文通过利用近等基因系进行了水稻抽穗期QTL-DTH3b的精细定位以及长芒基因Awn3的图位克隆。抽穗期是影响水稻适应季节适应性和区域分布的重要农艺性状之一。本文鉴定了一个在长日照条件下促进水稻开花的微效数量性状位点DTH3b，并最终将其精细定位到46kb的物理区间内。DTH3b在长日照条件下是独立于水稻光周期途径中的两个重要开花整合因子Hd1和Ehd1而直接上调两个成花素基因Hd3a和RFT1的表达来促进开花的。芒是水稻外稃顶端中肋延伸形成的结构，长芒表型严重影响水稻的收割。本研究在两个无芒品种粳稻Asomonori(Aso)和籼稻IR24所构建的高代群体中检测到了一个调控水稻长芒表型的数量性状位点Awn3，并对其进行了精细定位和分子克隆。Awn3基因编码一个含多个结构域的膜蛋白，来自籼稻IR24的Awn3位点在第二外显子处因发生单碱基突变导致提前终止从而形成一个只包含55个氨基酸的蛋白，因而表现为长芒表型。
　　1.本实验室前期的研究中检测到一个位于3号染色体短臂中部的抽穗期微效QTL-qDTH-3b（本研究中命名为DTH3b），但未进一步深入研究，本研究中我们分离了一个以Aso为背景且只包含12cM来自IR24的DTH3b位点片段的近等基因系NIL(DTH3b)。DTH3b的LOD值为5.46，在NIL(DTH3b)和Aso的F2群体中对表型分离解释的贡献率为27.37％。利用1500个极端晚抽穗的F2∶3家系最终将DTH3b最终精细定位到46kb的基因组区间内。
　　2.在北京自然长日照条件下，NIL(DTH3b)的抽穗期比Aso延迟6.9天，在受控制的长日照条件下，NIL(DTH3b)也比Aso晚抽穗9.8天，而在海南自然短日照条件下及受控制的短日照条件下二者抽穗差异不显著。在北京NLD条件下分别考察Aso抽穗60天后的Aso和NIL(DTH3b)种子的成熟度，发现Aso的种子成熟度比NIL(DTH3b)高出52％，但在NSD条件下，二者的种子成熟度都能达到100％。此外，Aso和NIL(DTH3b)的出叶速率在CLD和CSD条件下都没有显著差异。表明DTH3b是一个水稻长日特异的开花调节子，来自Aso的DTH3b等位基因能更好地适应NLD条件。
　　3.QRT-PCR结果显示，在CLD条件下，与NIL(DTH3b)相比，Aso中的两个成花素基因Hd3a、RFT1及成花素下游的OsMADS14、OsMADS15的表达量都有显著上调，而水稻光周期途径中两个主要的开花整合因子Hd1和Ehd的表达量没有显著差异。此外我们还检测了Hd1和Ehd1上游的6个主要开花促进因子OsGI、RID1/ OsID1/Ehd2、Ehd3、Ehd4、OsMADS50和OsMADS51以及6个开花主要抑制因子Ghd7、DTH8/Ghd8、OsMADS56、OsCOL4、PHYB和SE5的表达量，发现这些基因的表达量在二者中都没有显著差异。表明DTH3b在长日照条件下是独立于Hd1和Ehd1而直接上调两个成花素基因Hd3a和RFT1的表达来促进水稻开花的。
　　4.本研究发现两个无芒品种Aso和IR24所建构的染色体片段置换系CSSL23中存在明显的长芒表型，利用其与Aso杂交的后代群体在3号染色体着丝粒附近检测到一个在多环境中稳定存在的长芒表型主效QTL，命名为Awn3，并分离出一个只包含27.2cM来自IR24片段的近等基因系NIL(Awn3)。遗传分析表明Awn3为单个孟德尔遗传因子，LOD值为18.97，在Aso×NIL(Awn3)的F2群体中能解释55.17％的表型变异。
　　5.分别考察Aso和NIL(Awn3)在不同环境条件下的长芒表型，二者的芒表型差异均达到显著水平，且长芒表型受光照时间长短影响，芒长度及有芒颖花率高低与光照时间长短呈正相关关系。
　　6.利用Aso与NIL(Awn3)杂交的F2群体中选取的1300个有芒颖花率高的极端个体，最终将Awn3定位到一个12.3 kb的基因组区间内，该区间仅包含一个完整的候选基因，基因号为Os03g0407400。与Aso相比，来自IR24的Os03g0407400等位基因在编码区第165 bp位置发生单碱基突变形成终止子并编码一个截短的蛋白，因此推断Os03g0407400极有可能就是长芒表型的目的基因。分别构建Os03g0407400的基因组全长和强启动子过表达载体，并分别转化NIL(Awn3)，均能互补NIL(Awn3)的长芒表型，表明Os03g0407400即为长芒表型的目的基因Awn3。
　　7.Awn3在植株中为组威型表达，在根、茎、叶、穗、芒中均有表达，在幼穗中的表达量最高。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 文献综述

1 植物开花的基本研究

1．1 植物开花的成花素假说

1．2 调控植物开花的信号途径

2 水稻开花的基本研究

2．1 水稻抽穗期QTL的研究现状

2．2 水稻抽穗期QTL间的互作

2．3 水稻抽穗期基因／QTL的克隆与功能分析

3 本研究的目的和意义

第二章 水稻抽穗期QTL-DTH3b的精细定位与侯选基因预测

1 材料与方法

1．1 NIL的分离

1．2 田间栽培

1．3 控制条件下栽培

1．4 性状考察

1．5 DNA的提取

1．6 PCR反应

1．7 分子标记开发

1．8 QTL分析

1．9 候选基因预测与测序分析

1．10 节律表达材料的种植与取样

1．11 RNA提取与Quantitative RT-PCR分析

2 结果与分析

2．1 抽穗期QTL分析和NIL(DTH3b)的分离

2．2 表型描述

2．3 DTH3b的精细定位

2．4 交换单株的后代验证

2．5 定位区间内DTH3b的候选基因预测

2．6 DTH3b在LD下通过上调成花素基因Hd3a和RFT1来调控水稻开花

3 讨论

3．1 DTH3b或为一个新的抽穗期位点且编码新型的抽穗期基因

3．2 DTH3b或独立于Hd1和Ehd1途径直接调控Hd3α和RFT1的表达

3．3 DTH3b或能应用到未来的育种工作中

第三章 文献综述

1 植物的驯化

2 植物的返祖现象

2．1 返祖现象的发现

2．2 返祖现象的产生原因

3 水稻长芒基因的研究概况

3．1 水稻长芒表型的QTLs的定位

3．2 水稻芒表型的QTL／基因的克隆与功能分析

4 已克隆的粒长相关QTL／基因

5 本研究的研究意义

第四章 水稻长芒基因Awn3的图位克隆

1 材料与方法

1．1 NIL的分离

1．2 田间栽培

1．3 性状考察

1．4 DNA提取

1．5 RNA提取

1．6 QTL分析及分子标记开发

1．7 候选基因预测与测序分析

1．8 水稻遗传转化的载体构建

1．9 水稻遗传转化

2 结果与分析

2．1 长芒表型的QTL分析及NIL(Awn3)分离

2．2 NIL(Awn3)在不同环境条件下的芒表型

2．3 Awn3的芒表型在F2群体中的分布

2．4 Awn3的精细定位

2．5 Awn3的候选基因预测

2．6 转基因功能验证

2．7 Awn3编码蛋白的结构域分析

2．8 Awn3的表达分析

3 讨论

3．1 Awn3是水稻中第二个成功克隆的长芒基因

3．2 Awn3具有一因多效性

3．3 芒与人工选择的关系

第五章 全文结论

本研究的创新点

参考文献

附录

博士在读期间发表的学术论文

致谢