棉花耐盐材料的筛选及耐盐相关功能标记的开发

摘要

棉花是一种耐盐性比较强的植物，是开发利用盐碱地的先锋作物，应用棉花耐盐的生物学特性发展盐碱地植棉是缓解粮棉争地矛盾、提升棉花产量的有效途径，然而棉花栽培种耐盐总体水平不高并且基础种质过于集中，耐盐品种的遗传基础相当狭窄;近年来，为探寻植物的耐盐性，转录组测序被国内外学者们使用，它能快速鉴定与表型相关的基因标签，利用其开发耐盐性功能标记，通过分子标记选择目标性状能有效提高育种工作的效率，该技术已经作为一种辅助选择手段广泛应用于现代育种过程中。为拓宽陆地棉耐盐性的遗传基础以及提高陆地棉耐盐性改良的选择效率，我们开展了如下研究:
　　1.为了拓宽陆地棉耐盐性的遗传多样性，我们针对本实验构建的（陆地棉泗棉2号×克劳茨基棉）×泗棉2号的BC2F7327个家系，利用200mmol NaCl溶液进行萌发期的耐盐性鉴定，筛选出13个相对发芽率超过49％，与盐敏感对照(苏棉12号:25.47％)差异达显著水平的新材料;进而对这13材料进行苗期的耐盐鉴定，测定苗期子叶受害程度，叶绿素含量，株高以及根、茎、叶干物重等生理指标;使用SPSS16.0软件主成分分析，将单个盐害系数综合成几个新的综合指标，再利用隶属函数值和权重计算综合评价值。结果表明家系A2059、A2327和A2104为高耐盐材料，A2130和A2121为耐盐材料。
　　2.利用耐盐材料Miscot7913-83与盐敏感品种苏棉12号为材料，提取经200mmol NaCl溶液处理0h、12h和72h根和叶片组织的RNA，使用Illumina测序平台进行转录组测序，依据无参考基因组的转录组de novo拼接方法，获得盐胁迫下的根和叶转录组数据，以及各个时期的DGE。对拼接处理得到的unigenes进行7大数据库进行注释(NR、NT、KO、SwissProt、PFAM、GO、KOG数据库)，成功注释的基因数目及比例分别为:37，682(52.11％)、24，990(34.56％)、11，901(16.46％)、26,192(36.22％)、24,812(34.31％)、29,080(40.22％)和13,549(18.73％)。DGE分析结果显示处理12h、72h时，Miscot7913-83和苏12的相同组织相同时期之间差异表达的基因总共3232个;根中共同差异表达基因459个;叶中共同差异表达基因106个;分别对根和叶中共同差异基因进行GO和KEGG分析，结果表明抗氧化反应、脂肪酸代谢、氨基糖代谢、光合作用等方面在应答盐胁迫具有重要作用。
　　3.利用基于Bioperl的Bio∷PrimerDesigner模块和primer3从上述差异表达基因中批量设计功能性分子标记，获得60对EST-InDel引物。利用MISA查找SSR位点，primer3设计SSR引物有68对。对96份国内外陆地棉材料基因型分析结果显示，其中InDel引物产生多态性产物的8对，占总数的13.3％;SSR引物具多态性的有11对，占16.2％。测定自然群体萌发期的相对发芽势和相对发芽率，采用t测验对表型和基因型进行相关性分析，结果表明:与相对发芽势显著相关的标记为Jaas_7058和InDel_227，分别解释9.7％和5.7％的表型变异;与相对发芽率显著相关的标记为InDel_94和Jaas_7025，分别解释8.4％和2.8％的表型变异。

目录

声明

摘要

本文所用主要缩略词

第一章 棉花耐盐性研究动态

1 盐胁迫对棉花生长的影响

1．1 盐胁迫对棉花萌发的影响

1．2 盐胁迫对棉花根系的影响

1．3 盐胁迫对棉花光合的影响

2 棉花的耐盐机制

2．1 离子渗透调节和分区隔离

2．2 抗氧化系统调节

2．3 小分子渗透物质调节

3 棉花耐盐性的分子机制

3．1 耐盐基因的克隆

3．2 棉花耐盐性的转基因研究

4 棉花耐盐性鉴定方法

4．1 棉花耐盐性直接鉴定方法

4．2 棉花耐盐性间接鉴定方法

第二章 我国棉花耐盐种质资源研究现状

第三章 转录组测序技术及其应用

1 转录组项目流程

2 转录组测序样品

2．1 RNA样品要求

2．2 Total RNA样品检测

3 Illumina测序平台

4 转录组分析方法

4．1 有参考基因组转录组分析内容

4．2 无参考基因组转录组分析内容

5 表达量统计

6 转录组注释数据库

7 棉花盐胁迫转录组研究进展

第四章 功能标记研究进展

1 分子标记类型

2 功能标记介绍

2．1 功能标记的开发

3 功能标记的检测

3．1 等位基因特异性PCR

3．2 酶切扩增多态性序列

3．3 TP-M13自动荧光检测系统

本研究目的和意义

研究内容与技术路线

第五章 棉属野生种克劳茨基棉与陆地棉杂交后代耐盐性筛选

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 实验设计

1．3 测定指标标准与计算方法

1．4 数据处理

2 结果与分析

2．1 克劳茨基棉渐渗系的耐盐性鉴定

2．2 生长指标与耐盐性的关系

2．3 综合分析及评价

3 讨论

3．1 棉花萌发期与苗期耐盐性的筛选

3．2 数据处理的评价

第六章 盐胁迫下两个陆地棉品种的转录组测序

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 材料处理

1．3 试剂配制

1．4 提取样品总RNA步骤

1．5 去除总RNA中的DNA

1．6 Total RNA样品检测

1．7 文库构建及库检

1．8 unigene的注释

1．9 生物信息学分析软件

1．1 0 差异表达基因的筛选

2 结果与分析

2．1 初始产出数据

2．2 拼接转录本及unigene

2．3 基因功能注释

2．4 数字基因表达谱(DGE)分析

3 讨论

3．1 转录组测序

3．2 转录组拼接及分析

3．3 陆地棉耐盐分子机制

第七章 陆地棉耐盐功能标记的开发

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 功能性EST-InDel分子标记的开发

1．3 功能性EST-SSR分子标记的开发

1．4 萌发期发芽势、发芽率

1．5 棉花叶片DNA的提取

1．6 SSR和Indel扩增及PAGE银染检测

1．7 标记常用试剂的配方

2 结果与分析

2．1 功能标记的开发

2．2 陆地棉中多态性标记的筛选

2．3 与耐盐性连锁的功能标记的筛选

2．4 相关性分析

3 讨论

全文结论

附录

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间所发表论文