鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定及囊膜蛋白抗原表位的鉴定

摘要

鸭坦布苏病毒病(duck Tembusu virus disease)是于2010年在我国新出现的一种以采食、产蛋下降和瘫痪为特征的禽类传染病，其病原为鸭坦布苏病毒(duck Tembusuvirus，DTMUV)。DTMUV主要危害鸭和鹅，也有鸡群感染发病的报道，不同来源的DTMUV分离病毒株的基因同源性均高于98％。该病在蚊虫活跃季节发病率高，但冬季也有发病，因此传播途径不限于蚊媒。
　　鸭坦布苏病毒为黄病毒科、黄病毒属、恩塔亚病毒群中的坦布苏病毒(Tembusuvirus)。病毒的基因组为正股单链RNA，长约11 knt，基因组结构为5'UTR-C-prM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3'UTR。囊膜蛋白(E)是DTMUV主要的表面结构蛋白，参与病毒与宿主细胞受体的结合，含有病毒的主要中和抗原表位。DTMUV NS1蛋白参与病毒的组装，也可以二聚体或六聚体的形式分泌至胞外，拮抗宿主的先天性免疫。E蛋白和NS1蛋白为DTMUV的2个最主要免疫保护性抗原，关于其抗原表位信息报道较少。
　　本研究分离鉴定了一株鸭源坦布苏病毒，研究其生物学特性，测定其全基因序列，分析其基因进化特征。应用细胞融合技术制备了4株抗DTMUV E蛋白和NS1蛋白的单克隆抗体，其中针对E蛋白的单克隆抗体能区分DTMUV和日本脑炎病毒(JEV)抗原，DTMUV囊膜蛋白特异抗原表位的发现为DTMUV血清学诊断方法的建立奠定基础。具体研究如下:
　　1鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定与基因变异分析
　　2012年10月徐州地区某鸭场爆发了樱桃谷种鸭产蛋骤然下降的疫病，患病鸭表现为发热、采食减少、产蛋下降，剖检可见脾肿大、卵泡出血、萎缩等。本研究从送检病料中分离到一株鸭坦布苏病毒，命名为DTMUV XZ-2012株。DTMUV XZ-2012株能适应鸡胚培养，于BHK-21细胞上第5代的病毒滴度为5×104 PFU/mL。应用RT-PCR的方法扩增DTMUV XZ-2012基因，测序发现其基因组全长为10990nt，编码的多聚蛋白有3426个氨基酸。DTMUV XZ-2012株与文献报道的BYD株、YY5株、JS2010株等DTMUV的全基因同源性为98.5％-99.3％。与国内最初分离的DTMUVBYD株等相比，DTMUV XZ-2012的基因变异主要分布于E基因、NS1基因和NS2a基因，提示该病毒在自然界的流行存在一定的免疫压力。
　　2鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白单克隆抗体的制备与特性鉴定
　　用纯化的鸭坦布苏病毒重组EDⅢ蛋白免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体，共获得2株能稳定分泌抗鸭坦布苏病毒EDⅢ抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3C4和3D12。经间接ELISA测定，2株杂交瘤细胞培养上清效价均为1:12800。腹水效价分别为1×105和2×105。单克隆抗体亚类鉴定结果显示，3C4株单抗的亚类为IgG1κ型，3D12株单抗的亚类为IgG2bκ型。间接免疫荧光试验与Western blot鉴定结果表明3C4、3D12株杂交瘤细胞能特异性识别细胞中鸭坦布苏病毒的EDⅢ蛋白，与日本脑炎病毒没有交叉反应。中和试验显示这两株单抗没有中和活性。
　　3鸭坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备
　　利用纯化的鸭坦布苏病毒NS1蛋白免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体，共获得2株能稳定分泌抗鸭坦布苏病毒NS1蛋白抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2F6和2F12。经间接ELISA测定，2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1:6400、1∶12800。腹水效价均为1∶1×105。单克隆抗体亚类鉴定结果显示，2F6、2F12株单抗的亚类均为IgG1，2株单抗的轻链均为κ型。Western blot与间接免疫荧光试验鉴定结果表明2F6、2F12株杂交瘤细胞能特异性识别DTMUV接种细胞中的NS1蛋，2F12与日本脑炎病毒接种细胞有交叉反应，2F6与JEV NS1没有交叉反应。
　　4鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白B细胞表位的鉴定
　　为了对获得的2株抗鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白的单克隆抗体所针对的抗原表位进行精确定位，本研究通过原核表达了截短的EDⅢ蛋白，人工合成了多肽抗原。通过ELISA和Western blot方法精确定位了这两株单克隆抗体所识别的抗原表位。结果显示这两株囊膜蛋白单克隆抗体针对的是同一表位310SLVKNP315。经分析发现该表位高度保守，且与其他黄病毒不交叉。以上结果丰富了鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白抗原表位图谱，为EDⅢ蛋白相关功能的进一步研究和鸭坦布苏病毒鉴别诊断奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 鸭坦布苏病毒概述

1 病原学分类

2 形态结构及理化培养特性

3 基因结构及蛋白特性

4 流行病学特征

5 病毒对动物的致病性

6 病毒感染的诊断方法

6．1 临床诊断

6．2 实验室诊断

7 预防和控制

参考文献

第二章 鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定与基因变异分析

1 试验材料

2 试验方法

2．1 病料的采集及处理

2．2 接种SPF鸡胚分离毒株

2．3 RT-PCR鉴定鸭坦布苏病毒

2．4 血凝试验

2．5 分离毒株的细胞培养

2．6 空斑形成试验

2．7 引物设计

2．8 基因组RT-PCR扩增

2．9 基因克隆及测序

2．10 序列分析

3 结果

3．1 疑似鸭坦布苏病毒病病鸭的病变特征

3．2 DTMUV XZ-2012株的分离与RT-PCR鉴定

3．3 DTMUV XZ-2012株接种BHK-21细胞的病变特征

3．4 DTMUV XZ-2012空斑形成试验结果

3．5 DTMUV XZ-2012株全基因RT-PCR扩增结果

3．6 DTMUV XZ-2012株基因序列分析

2．6 DTMUV XZ-2012株基因进化树和同源性分析

2．7 DTMUV XZ-2012株各基因与BYD株和Shandong1株的比较分析

4 讨论

参考文献

第三章 鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白单克隆抗体的制备与特性鉴定

1 试验材料

2 试验方法

2．1 DTMUV EDⅢ蛋白的表达及纯化

2．2 小鼠免疫

2．3 SP2／0骨髓瘤细胞的复苏及准备

2．4 饲养细胞的制备

2．5 免疫小鼠脾细胞的制备

2．6 细胞融合

2．7 阳性杂交瘤细胞的筛选

2．8 杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)培养以及冻存

2．9 单克隆抗体的制备

2．10 单克隆抗体的Western blot鉴定

2．11 单克隆抗体的间接免疫荧光(IFA)分析

2．12 抗体分泌稳定性的鉴定

2．13 腹水抗体效价测定

2．14 单克隆抗体亚类和型的鉴定

2．15 单克隆抗体与日本脑炎病毒的反应检测

2．16 单克隆抗体中和活性的测定

3 结果

3．1 抗原的制备纯化结果

3．2 杂交瘤细胞株的建立

3．3 Western blot分析结果

3．4 间接免疫荧光(IFA)分析结果

3．5 抗体分泌稳定性的鉴定结果

3．6 腹水抗体效价测定结果

3．7 单克隆抗体亚类和型的鉴定结果

3．8 单克隆抗体与日本脑炎病毒的交叉反应结果

3．9 单克隆抗体中和活性的测定结果

4 讨论

参考文献

第四章 鸭坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备

1 试验材料

2 试验方法

2．1 DTMUV NS1蛋白的表达及纯化

2．2 动物免疫

2．3 SP2／0骨髓瘤细胞的复苏及准备

2．4 饲养细胞的制备

2．5 免疫小鼠脾细胞的制备

2．6 细胞融合

2．7 阳性杂交瘤细胞的筛选

2．8 杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)培养以及冻存

2．9 单克隆抗体制备

2．10 单克隆抗体的Western blot鉴定

2．11 单克隆抗体的间接免疫荧光(IFA)分析

2．12 抗体分泌稳定性的鉴定

2．13 腹水抗体效价测定

2．14 单克隆抗体亚类和型的鉴定

2．15 单克隆抗体与日本脑炎病毒的反应检测

3 结果

3．1 抗原的制备纯化结果

3．2 杂交瘤细胞株的建立

3．3 Western blot分析

3．4 间接免疫荧光(IFA)分析结果

3．5 抗体分泌稳定性的鉴定结果

3．6 腹水抗体效价测定结果

3．7 单克隆抗体亚类和型的鉴定结果

3．8 单克隆抗体与日本脑炎病毒的交叉反应结果

3 讨论

参考文献

第五章 鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白B细胞表位的鉴定

1 试验材料

2 试验方法

2．1 引物的设计

2．2 目的基因的扩增

2．3 目的基因与pGEX-6p-1载体的酶切处理

2．4 重组质粒的构建

2．5 感受态的制备及转化

2．6 重组质粒的鉴定

2．7 目的蛋白的表达与鉴定

2．8 目的蛋白的SDS-PAGE电泳分析

2．9 EDⅢ蛋白B细胞表位鉴定

2．10 鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白抗原表位的变异分析

2．11 鸭坦布苏病毒EDⅢ蛋白抗原表位交叉性分析

3 结果

3．1 鸭坦布苏病毒EDⅢ截短蛋白的表达

3．2 Western blot鉴定单克隆抗体与截短蛋白反应性

3．3 合成肽的ELISA鉴定

3．4 融合肽的表达及western blot鉴定

3．5 EDⅢ蛋白抗原表位的变异分析

4 讨论

参考文献

全文总结

致谢