马立克氏病meq基因转染CEF后部分微卫星不稳定性和错配修复基因的研究

摘要

鸡马立克氏病(Marek's Disease，MD)是一种由血清型Ⅰ型马立克氏病毒(Marek's DiseaseⅥrus，MDV)引起的T淋巴细胞肿瘤性疾病，具有高度的传染性。MDV是唯一已知能急性转化的α疱疹病毒。MDV不仅可引起患鸡内脏T细胞淋巴瘤、瘫痪、失明和神经功能障碍，而且还可以引起较强的免疫抑制。微卫星(Microsatellite，MS)是一个位点特异的DNA序列，它们的核苷酸序列较短（重复单元为1-6个碱基对），核苷酸序列串联重复10-60次，其侧翼为独特的序列。在生物体基因组中，微卫星是有高丰度的特异性DNA标记。微卫星不稳定性(Microsatellite Instability，MSI)是由于复制错误（replication error，RER）引起的微卫星等位基因的增加或丢失，造成微卫星DNA长度发生改变，表现为(CA)n双核苷酸电泳迁移率的改变，出现与正常基因长度不同的等位基因条带。错配修复基因(Mismatch Repair，MMR)是切除修复未成对或错配的碱基并通过替换正确的DNA碱基对的一组基因。本试验对马立克氏病meq基因转染鸡胚成纤维细胞(CEF)后部分微卫星不稳定性和错配修复基因表达情况进行研究。研究目的是为马立克氏病meq基因的致瘤机制提供线索，试验分为以下三部分。
　　第一部分是pVAX-1-meq真核表达载体的构建和在鸡胚成纤维细胞中表达验证。采用TA克隆将MEQ基因片段连接pMD19-T Vector构建出pMD19-T-meq质粒，pMD19-T-meq质粒和pVAX-1真核表达质粒采用EcorRⅠ、XhoⅠ限制性内切酶双酶切，将meq基因ORF克隆至pVAX-1质粒中，构建pVAX-1-meq真核表达质粒。转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆采用pVAX-1质粒通用引物T7 primer和BGH reverse primer进行PCR验证和EcorRⅠ、XhoⅠ限制性内切酶双酶切验证。将pVAX-1-meq真核表达质粒用转染试剂转染至鸡胚成纤维细胞，并分别在转染后的24 h、48 h、72 h提取贴壁细胞总RNA，反转录成cDNA，根据meq基因mRNA设计引物MEQ mRNA F/R，以β-actin作为内参进行real-time PCR反应，检测出meq基因mRNA成功在细胞内表达。比较正常细胞和转染meq基因的细胞增殖，细胞凋亡，细胞周期的指标。转染meq基因后细胞凋亡率并未明显改变，细胞周期失控，G2期和S期阻滞，DNA复制过程受阻，MTT法检测发现细胞活性降低，说明转染MEQ基因至CEF细胞后并未使得CEF细胞发生转化，但会引起CEF的DNA合成受阻。
　　试验第二部分是把构建好的pVAX-1-meq真核表达质粒用转染试剂转染至鸡胚成纤维细胞，同时设置空载体对照组、脂质体对照组和空白对照组，并分别在转染后的24h、48h、72h提取贴壁细胞总DNA;选取本实验室前期初步筛选的马立克氏病肿瘤中变化频率较高的微卫星标记，以此微卫星位点设计了46对引物，以提取的DNA进行PCR扩增，采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测微卫星不稳定性，根据银染后的结果来看，并未发现实验组与对照组有明显的微卫星条带差异。
　　试验第三部分是把构建好的pVAX-1-meq真核表达质粒用转染试剂转染至鸡胚成纤维细胞，同时设置空载体对照组、脂质体对照组和空白对照组，并分别在转染后的24h、48h、72h以β-actin作为内参进行real-time PCR反应，检测错配修复相关基因MLH1，MSH2和PMS1的mRNA表达情况，结果发现转染meq基因后24h，错配修复基因MLH1，MSH2和PMS1的相对表达量较各个对照组均有不同程度升高，而转染meq基因后48h、72h错配修复基因MLH1，MSH2和PMS1的相对表达量又低于对照组。这表明转染meq基因后24h错配修复系统开始发挥其功能，而在转染meq基因后48h和72h错配修复系统功能开始减弱或消失，这说明meq基因参与了错配修复相关基因的表达调控。

目录

声明

摘要

文中所引部分缩略语

前言

第一章 鸡马立克氏病综述

1 病原

2 发病机制

3 meq基因及致病机理

4 流行病学

5 临床症状

5．1 内脏型

5．2 神经型

5．3 眼型

5．4 皮肤型

6 组织病理学和病理变化

7 诊断

8 防控

参考文献

第二章 微卫星不稳定性和错配修复综述

1 微卫星

1．1 微卫星简介

1．2 微卫星的功能与特点

2 微卫星不稳定性

3 错配修复基因及其相关机制

4 错配修复基因与微卫星不稳定性的关系

参考文献

第三章 马立克氏病病毒meq基因真核表达载体的构建

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 meq克隆及测序

2．2 真核表达载体构建及鉴定

2．3 荧光定量结果

2．4 细胞凋亡结果

2．5 细胞周期结果

2．6 MTT法结果

3 讨论

参考文献

第四章 meq基因转染CEF后部分微卫星不稳定性的探究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 聚丙烯酰胺电泳结果

3 讨论

参考文献

第五章 马立克氏病meq基因转染CEF后错配修复基因的表达分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

1．3 实时荧光定量PCR

2 结果

2．1 标准曲线

2．2 MLH1基因的mRNA平均相对表达量

2．3 MSH2基因的mRNA平均相对表达量

2．4 PMS1基因的mRNA平均相对表达量

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢